Establishment of a multiplexed opsonophagocytic assay for additional 11 pneumococcal serotypes in the 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine

Abstract

Background: Streptococcus pneumoniae colonizes the nasopharynx and is a major cause of infectious disease. Various pneumococcal vaccines have been developed and evaluated for immunogenicity by opsonophagocytic assay (OPA). A multiplexed OPA (MOPA) for 26 pneumococcal serotypes was previously established by Nahm and Burton; however, the creation of new conjugate vaccines with increased valence has encouraged the development of expanded MOPAs to encompass these additional serotypes. Methods: All materials—including serum, complement, bacterial master stocks, and HL-60 cells—were properly prepared and evaluated for assay optimization. Bacterial stocks were examined for viability and antibacterial resistance after freeze-thaw, while the potential for HL-60 cells to undergo phagocyte differentiation was examined by flow cytometry. Nonspecific killing assays were used to screen complement and fetal bovine serum sources. Following optimization,the assay was validated for accuracy, specificity, and intra- and inter-assay precision with sera from 15 adult donors using standard protocols. Results: The expanded MOPA platform was specific for all serotypes with the exception of serotype 20. Assay accuracy revealed a strong correlation with data obtained from single-serotype OPA (SOPA) tests. Additionally, the coefficients of variation were 7–24% and 13–39% for intra- and inter-assay precision studies,respectively, using three quality-controlled samples. Conclusion: A MOPA that includes the 11 additional serotypes in the 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine (PPV23) was developed and validated with respect to the assay’s accuracy, specificity, and precision. These results suggest that the expanded MOPA may be useful to evaluate the efficacy of PPV23 and future conjugate vaccine formulations.;배경: 폐렴사슬알균은 사람의 비인두에 상주하는 균으로 폐렴, 부비동염, 중이염, 패혈증, 뇌수막염 등 다양한 질병을 일으키는 균이다. 지난 수십 년 동안 이러한 폐구균에 의한 칩습성 감염병을 예방하고자 다양한 백신이 개발되었고, opsonophagocytic assay (OPA) 는 생체외 실험법 중 폐구균 백신의 면역원성을 평가하는 데에 매우 유용한 기능적 검사법이다. 2012년 미국의 University of Alabama 의 남박사와 Burton 박사가 26개의 혈청형에 대한 multiplexed OPA (MOPA)검사를 개발하였다. 폐구균에 의한 질병 발생의 증가로 인해 새로운 폐구균 단백결합백신이 계속 개발됨에 따라, 11개 추가 혈청형인 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F, 그리고 33F 에 대한 MOPA 검사 및 유효성 평가가 필요하게 되었다. 방법: MOPA 검사를 위해 11개 혈청형의 폐구균 균주, 보체, 혈청 및 HL-60 세포를 준비하였고, 각각이 실험에 사용되기에 적합한지를 먼저 평가하였다. 즉, 균주의 적합성을 평가하기 위해 균을 녹이기 전후의 생존 균수를 비교하여 균의 생존 능력을 확인하였고, 각 폐구균 균주들이 정해진 항생제에 적합한 저항성을 가지고 있는지를 확인하였다. HL-60 세포의 분화도를 평가하기 위해 유세포분석기로 표면항원의 발현을 정량하였고, 보체와 소태아혈청의 비특이적 살균작용 정도를 평가 하였다. 적합한 상태의 검사 조건을 갖춘 후, MOPA 검사의 유효성 평가를 위해 정확도, 특이도, 및 검사 내, 검사 간의 재현성을 평가하였다. MOPA 검사의 프로토콜 www.vaccine.uab.edu 사이트의 UAB-MOPA 프로토콜을 따랐다. 결과: MOPA 검사의 핵심 요소인 폐구균, HL-60 세포, 보체, 그리고 혈청이 검사 기준에 적합하였다. MOPA 검사의 정확도는 15개의 개별 혈청을 이용하여 단일혈청형 OPA인 SOPA 검사 결과와 4개의 혈청형을 한꺼번에 검사하는 MOPA 검사 결과를 비교하여 평가하였다. SOPA 검사와 MOPA 검사를 통해 산출된 옵소닌 지수는 높은 일치도를 보였다. MOPA 검사는 혈청형 20을 제외하고 나머지 10개의 혈청형에 대하여는 높은 특이도를 보였다. 검사의 재현성은 세개의 표준혈청으로 검사하였는데 검사 내 재현성의 변동계수는 7~24%, 검사 간 변동계수는 13~39%의 수치를 보였다. 결론: 본 연구를 통하여 PPV23 백신에 포함된 11개 혈청형에 대한 MOPA 검사의 일치도, 특이도, 그리고 재현성에 대한 유효성 평가를 확립하였다. 이 연구를 통해 얻어진 추가 혈청형에 대한 결과들은 PPV23 백신뿐만 아니라 앞으로 개발되는 폐구균 백신의 평가에 유용하게 사용될 것으로 기대한다.