Phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase at serine 116 regulates cell cycle and angiogenesis

Abstract

혈관질환을 이해하는데 중요한 것으로 알려진 혈관내피세포 (endothelial cells)유래 일산화질소(nitric oxide, NO)는 혈관을 확장시키고 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells)의 증식과 분열을 억제한다고 알려져 있다. 그러나 현재까지 NO를 직접 생성하는 혈관내피세포의 세포주기조절과 NO의 관련성은 명확하게 밝혀지지 않았다. 혈관내피세포의 NO는 혈관내피세포 일산화질소 생성효소(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)에 의해 생산되는데 이러한 NO의 생산은 eNOS 여러 특정부위의 인산화에 의해 조절된다. 따라서 본 연구는 eNOS에 의한 NO발생이 혈관내피세포의 세포주기를 조절하는지를 탐색하고 그 분자적 기전을 밝힘으로써 혈관내피세포 세포주기 조절자로서의 NO의 역할을 새롭게 규명하고자 한다. 세포주기 특이적 약물들을 소의 대동맥 혈관내피세포(bovine aortic endothelial cells, BAEC)에 처리한 결과 혈관내피세포의 세포주기에 따라 NO의 생성과 eNOS의 116번째 위치인 세린 잔기(eNOS-Ser116)의 인산화도가 변화하는 것을 관찰하였다. eNOS-Ser116 인산화의 경우 eNOS활성을 억제시키며 NO생산을 감소 시키는 것으로 알려져 있는데 주목할만한 결과로 G2/M기 특이적 약물인 nocodazole이 현저하게 NO의 생산을 감소시키고 eNOS-Ser116 인산화도를 증가시킨 것을 관찰 할 수 있었다. 이를 통해 eNOS-Ser116 인산화가 혈관내피세포의 세포주기조절, 특히 G2/M기에서 중요한 역할을 할 것이라는 가설을 세우게 되었다. 추가적으로 혈관내피세포에서 G2/M기에 증가하는 eNOS-Ser116 인산화가 어떤 인산화효소에 의해 매개 되는지를 연구하였다. Polo-like kinase 1(PLK1)은 대표적인 G2/M기 특이적 인산화효소로서 다양한 암들에서 그 발현이 증가되어있다고 알려져 있다. PLK1을 eNOS-Ser116에 대한 G2/M기 특이적 인산화효소 후보로 생각하고 연구를 진행하였다. PLK1에 선택적으로 작용하는 약물인 BI 2536을 처리하거나 우성음성체(dominant-negative)를 발현 시켰을 때, G2/M기에 증가하였던 eNOS-Ser116 인산화가 억제되고 감소되었던 NO생산이 기존 수준으로 회복되었다. 또한 공동면역침강법과 면역형광법을 통해 G2/M기 혈관내피세포에서 eNOS와 PLK1 두 단백질의 결합과 상호작용을 보았다. 추가적으로 시험관 내에서 재조합 PLK1 단백질이 직접 eNOS-Ser116을 인산화 시키는 것을 확인함으로써 PLK1이 G2/M기에서 eNOS-Ser116 인산화를 매개하는 새로운 인산화 효소임을 밝혔다. 혈관내피세포의 세포주기 조절과정 중 G2/M기에서 PLK1에 의한 eNOS-Ser116 인산화와 NO의 감소가 일어나는 것을 관찰하였고 더 나아가 혈관내피세포의 세포주기조절과 밀접한 관련이 있는 혈관신생과정에 있어 eNOS-Ser116 인산화의 역할을 더 자세히 알아보기로 하였다. eNOS-Ser116의 인산화형 또는 탈인산화형 돌연변이를 제작하여 발현시켰을 때 혈관내피세포의 세포주기 및 그에 수반한 혈관내피세포의 증식, 이동, 혈관신생과정을 관찰하였다. eNOS-Ser116의 인산화형 돌연변이를 발현한 경우 G2/M기 혈관내피세포가 유의하게 증가하였고 이후 혈관내피세포의 증식, 이동, 혈관신생과정이 향상되었다. 이와는 반대로 eNOS-Ser116의 탈인산화형 돌연변이는 nocodazole에 의한 G2/M기 혈관내피세포 증가를 억제하였고 또한 혈관내피세포의 증식, 이동, 혈관신생과정을 억제하였다. 즉 eNOS-Ser116의 인산화가 G2/M기 혈관내피세포의 숫자를 증가시킴으로써 이것이 혈관내피세포의 증식으로 이어지고 이와 동시에 혈관내피세포의 이동을 증가시켜 혈관신생과정을 촉진시킨다는 것을 알게 되었다. 결론적으로 eNOS-Ser116 인산화와 그에 따른 NO 생산이 혈관내피세포의 세포주기 조절 기전에 중요하며 특히 G2/M기에서 PLK1이 eNOS-Ser116 인산화를 증가시킨다는 것을 밝혔다. 또한 eNOS-Ser116의 인산화가 G2/M기 혈관내피세포 숫자를 증가시키며 이어 혈관내피세포의 증식, 이동, 혈관신생을 촉진시킴을 보았다. 이로써 본 연구는 eNOS-Ser116 인산화와 그에 따른 NO 생산이 혈관내피세포의 세포주기조절 미치는 영향과 분자적 기전을 처음으로 밝혔으며 앞으로 혈관신생과 관련된 심혈관계 질환과 암 등을 연구하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다.;NO was reported to regulate cell cycle, but yet its underlying mechanism remains less clear. NO production is mainly regulated by multiple phosphorylations of eNOS in EC. The present study investigates whether or how the phosphorylation at specific site of eNOS and subsequently released NO play a role in regulating EC cell cycle. Treatment of BAEC with mimosine, aphidicholin, or nocodazole, a drug inducing Go/G1, S, or G2/M phase of cell cycle, respectively, altered cell cycle-specific EC population and NO production. Compared with increased NO production by mimosine or aphidicolin, a significantly decreased NO production was found in nocodazole-treated EC. This decrease was accompanied by increased phosphorylation of eNOS at serine 116. Concurrently, increased expression and activity of PLK1, a mitosis-specific kinase, were observed in nocodazole-treated EC. Treatment with PLK1 inhibitor BI 2536 and ectopic expression of dominant-negative PLK1 attenuated nocodazole-stimulated phosphorylation of eNOS-Ser116. Furthermore, PLK1 phosphorylated directly eNOS-Ser116 in vitro. Coimmunoprecipitation and confocal microscopy studies revealed a physical interaction and a colocalization between eNOS and PLK1 in BAEC. Furthermore, transfection alone with the eNOS-S116D, the phosphomimetic form of eNOS-Ser116, significantly decreased NO production and increased G2/M cells, while no alteration was found in cells transfected with the eNOS-S116A, its dephosphorylated form. In contrast, nocodazole attenuated G2/M population in cells transfected with the eNOS-S116A but not with the eNOS-S116D. Expectedly, transfection with the eNOS-S116D increased G2/M-specific characteristics, such as cell proliferation, migration, and angiogenesis, while that with the eNOS-S116A attenuated G2/M-specific characteristics. Overall, these results show that decreased NO by PLK1-mediated eNOS-Ser116 phosphorylation is critical to regulating cell cycle, in particular G2/M phase in BAEC, and the regulation of eNOS-Ser116 phosphorylation may be the therapeutic target for angiogenesis-related diseases, such as cancer and diabetic retinopathy.