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Design of a Two-Vector System based on pcDNA3.3 for the Expression of Human IgG1

Title
Design of a Two-Vector System based on pcDNA3.3 for the Expression of Human IgG1
Authors
김민정
Issue Date
2018
Department/Major
대학원 바이오융합과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
심현보
Abstract
대부분의 파지 항체 라이브러리는 scFv 또는 Fab 분자로 구성되지만 일반적으로, 항원에 결합하는 항체를 찾은 후에 scFv 또는 Fab에서 IgG로 재구성 하는 과정이 필요하다. 우리 실험실에서는 IgG 생산을 위해 pVITRO1 이중 발현 벡터를 사용해 왔지만, 이 벡터 시스템에서 몇 가지 문제점을 발견했다. 첫째로, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 순차적으로 복제 해야 하기 때문에 플라스미드 DNA를 만드는 데 오랜 시간이 걸린다. 두 번째로, pVITRO1 벡터를 포함하는 대장균은 대체적으로 낮은 성장 속도를 나타내었고 이 때문에 실험에 사용할 충분한 양의 플라스미드를 준비하는 것에 어려움을 겪었다. 이러한 문제점들 때문에 우리는 pcDNA3.3을 기반으로 하는 새로운 두 벡터 시스템을 설계했다. 이 실험에서 우리는 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄의 불변 영역을 갖는 3 가지 유형의 pcDNA3.3 벡터를 각각 제작 하였다. 또한 IgG의 발현 수준을 높이기 위해 5' 말단에 인공 인트론을, 클로닝 부위의 3' 말단에 WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element)를 도입했고 새롭게 만들어진 이 벡터를 pcIW3.3이라고 이름 붙였다. pcIW3.3 벡터를 제작 한 후, WRS 항원에 결합하는 항체 클론을 pVITRO 벡터 및 pcIW3.3 벡터에 클로닝 하였다. 새로운 pcIW3.3 벡터는 pVITRO 벡터보다 더 높은 플라스미드 수율 및 단백질 정제 수율을 나타냈다. 또한 WPRE 및 인공 인트론의 도입 효과를 확인 하기 위해 허셉틴을 WPRE 및 인공 인트론 서열을 가지지 않는 pcDNA3.3 (old) 벡터와 pcIW3.3 벡터에 각각 클로닝 하였다. 허셉틴은 WPRE와 인공 인트론 서열을 가지는 pcIW3.3 벡터에서 더 높은 단백질 정제 수율을 보였다. 이러한 결과들로부터 새롭게 만들어진 pcIW3.3을 기반으로 하는 두 벡터 시스템이 재조합 단일 클론 항체의 개발에 보다 효율적인 도구가 될 것으로 기대한다.;Most phage antibody libraries consist of scFv or Fab molecules but usually reformatting from scFv or Fab into IgG is necessary after isolation of target binders for subsequent research. Our laboratory has been using a pVITRO1-based bicistronic vector for IgG production. We found some problems in this one vector system. First, it takes long time to construct plasmid DNA since the variable regions of heavy and light chain has to be cloned sequentially. Second, E.coli containing pVITRO1 vector showed low rate of growth and preparing sufficient quantity of plasmid was sometimes a troublesome problem. To overcome the problems, we designed a new two vector system based on pcDNA3.3. In this study, we made 3 types of pcDNA3.3-based vectors which have constant regions of heavy chain, kappa light chain, or lambda light chain, respectively. To enhance the expression level of IgG, an artificial intron at the 5’ end and WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element) at the 3’ end of the open reading frame were introduced. After construction of the new pcDNA3.3-based vectors which were named pcIW3.3pcIW3.3, anti-WRS clones were cloned into pVITRO vectors and pcIW3.3 vectors. The new pcIW3.3 vectors showed greater plasmid yields and protein purification yields than the pVITRO vector. Also, Herceptin was cloned into pcDNA3.3 (old) which doesn’t contain WPRE and artificial intron, and into pcIW3.3, in order to confirm the effect of introduction of WPRE and the artificial intron. More Herceptin was purified from new pcIW3.3 vector. As a results, the new two-vector IgG expression system is expected to provide a more efficient tool for the development of recombinant monoclonal antibodies.
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일반대학원 > 바이오융합과학과 > Theses_Master
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