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Transcriptome Analysis of Low-Oxygen Stress Responses in Arabidopsis

Title
Transcriptome Analysis of Low-Oxygen Stress Responses in Arabidopsis
Authors
황지혜
Issue Date
2012
Department/Major
대학원 생명·약학부생명과학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
이동희
Abstract
식물은 생장 환경에서 산소 결핍을 인지하고 그들의 저산소 내성을 증가시키기 위한 형태, 생리, 생화학적 메커니즘을 발전시켜왔다. 이 메커니즘은 많은 유전자 발현의 조절을 통해서 이루어진다. 그러므로 본 연구에서는 식물이 저산소 스트레스에 어떻게 반응하는지 알기 위해 애기장대 마이크로어레이를 이용하여 유전자 발현 프로파일링을 수행하고, 이 유전자 발현 프로파일을 세가지 다른 접근방식으로 해석하였다. 먼저 식물의 저산소 스트레스와 다른 환경스트레스에 대한 반응 사이에서 의미 있는 공통점을 조사하기 위해서 유전자 발현 프로파일을 비교 분석하였다. 애기장대 뿌리의 저산소 스트레스 처리(0.1% 산소/99.9% 질소)에 따른 유전자 발현 변화 분석을 Operon사의 애기장대 마이크로어레이를 이용하여 수행하고, 저산소 스트레스 초기 반응의 유전자 발현 프로파일은 AtGenExpress (http://www. weigelworld.org/resources/microarray/AtGenExpress/)의 데이터베이스로부터 얻은 총 8개의 저온(cold), 가뭄(drought), 유전자 독성물질(genotoxic), 고온(heat), 삼투(osmotic), 고염(salt), 유브이비(UV-B), 그리고 상처(wound) 스트레스의 유전자 발현 프로파일과 비교하였다. 이와 같은 비교분석으로부터 저산소 스트레스와 고온 스트레스의 초기 반응 메커니즘이 유사하다는 것을 발견하였다. 이들 스트레스에 대한 공통된 반응 메커니즘에 고온 스트레스 관련 유전자(heat stress-related genes) 발현의 활성화가 포함되어있다. 특히, small heat shock protein (sHSP)들이 저산소 스트레스와 고온 스트레스에 높은 발현을 보이는 것으로부터 sHSP의 발현 활성화가 두 스트레스 초기 반응 메커니즘에서 중요한 크로스톡(crosstalk) 포인트임을 알 수 있었다. 에너지 위기 상황을 초래하는 저산소 스트레스 내 반응에서 sHSP는 다른 HSP와 다르게 ATP 비의존적인 샤페론 기능으로 단백질 변성으로부터 보호하고 새로운 단백질의 합성에 사용되는 에너지를 줄여주는 역할을 할 것으로 예측된다. 두 번째는 저산소 스트레스에 대한 반응을 이해하기 위해 다양한 생물적 이벤트의 800여개의 마이크로어레이 데이터와의 유전자 그룹간의 거리 기준에 의한 분석(distance analysis)을 수행하였다. 이 분석 방법은 개념적으로 간단한 독립체의 부분 집합으로부터 복잡한 반응을 이해하는데 기반을 두고 있다. 이를 위해서 애기장대의 유전자 발현 데이터의 유전자세트를 이용한 마이크로어레이 데이터 분석법(GSEA)에 사용 할 수 있는 AraNet-based gene set과 MapMan-based gene set의 두 개의 유전자 그룹 (gene set) 데이터베이스를 만들었다. 두 개의 유전자 그룹 데이터베이스를 이용하여 대용량 마이크로어레이 데이터의 GSEA 분석으로부터 얻은 결과의 모음집으로부터 ‘Reference Gene Set catalog (RGS 카탈로그)’를 구성하였다. 저산소 스트레스 초기 반응의 유전자 그룹의 변화를 RGS 카탈로그와의 거리분석을 통해 개념적으로 간단한 조각들의 생물적 이벤트에 대한 반응들로 인지와 신호 전달, 생장과 발달의 조절, 메타볼릭 조절, 스트레스 특이적 항상성 그리고 손상 조절과 회복의 과정으로 분류하여 해석하였다. 이 과정에서 저산소 스트레스 반응과 브라시노스테로이드 생합성 관련 형질전환체(det2-1)의 유전자 발현변화가 유사한 것으로 나타났다. 실험적 검증으로부터 저산소 스트레스 하에서 애기장대 내부의 낮은 농도의 브라시노스테로이드는 외부에서 넣어준 브라시노스테로이드에 의해 충분한 양으로 저산소 스트레스 반응을 조절하고 내성을 증가시키는 것을 확인하였다. 마지막으로 십자화과에 속하는 10가지의 애기장대와 애기장대 근연종들의 저산소 스트레스에 대한 민감성을 조사하고 그들의 저산소 스트레스에 대한 민감성의 차이를 분자적 수준에서 이해하기 위해 유전자 발현 프로파일을 비교 분석하였다. 저산소 스트레스에 생리적 반응의 비교로부터 저산소 스트레스 내성이 큰 A. stelleri 와 R. islandica, 중간 정도 내성을 갖는 A. thaliana, 그리고 내성이 적은 T. salsuginea (Shandong ecotype)을 선별하고, 시간 별(0, 1, 3, 8, 24, 72 시간) 저산소 처리에 따른 각 종의 뿌리 내 유전자 발현 변화를 마이크로어레이를 이용하여 파악하였다. 유전자 발현 양상의 심층적 비교 분석을 위해서 MapMan-based gene set database를 이용한 GSEA 분석으로부터 각 종에서 공통되거나 특이적인 저산소 스트레스 반응을 이해할 수 있었다. 이들 반응 중 에너지 메타볼릭 패스웨이 (energy metabolic pathway)관련 유전자들의 발현 변화는 저산소 스트레스에 대한 내성 정도가 다른 근연종 간에 차별이 뚜렷하게 나타났다. 이러한 결과는 에너지 위기상황을 야기하는 산소 결핍 상황에서 에너지 메타볼릭 패스웨이 가동의 재구성에 따라 각 종의 저산소 스트레스에 대한 내성에 영향을 주는 것으로 판단된다. 그리고 여러 십자화과 식물의 저산소 스트레스 반응 비교로부터 저산소 스트레스 하에서 메타볼릭 패스웨이의 재구성은 수크로오스-스타치 메타볼리즘(sucrose-starch metabolism), 해당작용(glycolysis), 발효(fermentation)의 조절 향상과 트리카르복시산(TCA) 회로의 조정, 그리고 베타 산화(beta oxidation)와 글리옥실산회로(glyoxylate cycle)를 통한 지방산(fatty acid)분해의 증가를 포함하는 것을 알 수 있었다. 앞서 소개한 세가지 다른 접근방식으로부터 얻은 결과는 저산소 스트레스에 대한 식물 반응의 포괄적 이해를 돕고, 저산소 스트레스에 대한 민감성 차이를 분자적 수준에서 이해하는 데 기여하였다. 따라서 본 연구는 식물의 저산소 스트레스에 반응하는 전사 조절 네트워크를 해석하기 위해 현재까지 수행된 연구들의 가장 포괄적인 분석 중 하나임을 보여준다. 더 나아가서 본 연구 결과는 경제적으로 유용한 작물에 응용함으로써 저산소 스트레스에 내성이 강한 작물을 만드는데 기여할 것이다.;Plants have evolved adaptation mechanisms to sense oxygen deficiency in their environments and make coordinated physiological and structural adjustments to enhance their low-oxygen tolerance. These mechanisms are accompanied with massive changes in transcriptome composition. Therefore, to gain insight into how plants respond to low-oxygen stress, gene expression profiling using Arabidopsis near full genome long-oligomer microarrays was carried out, and these gene expression profiles were analyzed by three different approaches. First, a comparative analysis of gene expression profiles of low-oxygen stress and other abiotic stresses was performed to investigate a significant overlap between plant stress responses. The transcriptome analysis in A. thaliana root under low-oxygen stress (0.1% O2/99.9% N2) was carried out using Operon Arabidopsis microarray, and the gene expression profiles of early response to low-oxygen stress was compared with those to 8 abiotic stresses including cold, drought, genotoxic, heat, osmotic, salt, UV-B, and wound stress obtained from database of AtGenExpress (http://www.weigelworld.org/resources/microarray/AtGenExpress/). From compara -tive analysis, it was observed that the early response to low-oxygen stress was most similar to that to heat stress compared with other abiotic stresses. Transcriptional activation of heat stress-related genes was involved in common mechanisms between acclimations to low-oxygen stress and heat stress. Especially, small heat shock protein (sHSP) family members among heat stress-related genes were highly expressed in both stresses, suggesting that sHSP activation was an important crosstalk point in common mechanisms between acclimations to low-oxygen stress and heat stress. sHSPs induced by low-oxygen stress and heat stress may act as molecular chaperones, preventing the denaturation of proteins and reducing the energy-dependent process of new protein synthesis. Second, two different gene set databases and Reference Gene Set (RGS) catalogs were constructed for interpreting a complex expression data of Arabidopsis by breaking it up into conceptually simple entities. Gene set databases of AraNet-based gene sets and MapMan-based gene sets were constructed for Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) of gene expression data in Arabidopsis research. From GSEA using these gene sets, there was RGS catalog I or RGS catalog II depending on a collection of enrichment data at gene set level converted from the large-scale Arabidopsis microarray expression data at gene level. For interpretation of the low-oxygen stress response in A. thaliana root, the distance analysis with RGS catalog I or II was applied to the enrichment data of low-oxygen stress response. From this analysis, the complex response to low-oxygen stress was interpreted by a subset of responses to various biological events, as conceptually manageable pieces. In summary of low-oxygen stress response based on five major processes, it was observed that plants in low-oxygen condition negatively regulated the transcriptional response for the growth control and developmental adjustment, and the metabolic adjustment through the activation of this sensing and signaling, whereas they positively regulated the transcriptional response for stress-specific homeostasis, and damage control and repair. From the application of low-oxygen stress response to the distance analysis with RGS catalogs, it was found that changes in gene expression to low-oxygen stress response were similar to those of BR-biosynthesis mutant (det2-1). The results of the experimental tests suggested that low BR level in plant under low-oxygen stress was readily solved by exogenous BR, and this sufficient level of BR in plant controls stress response and enhances tolerance to low-oxygen stress. Finally, to compare tolerance and understand the difference in degree of tolerance to low-oxygen stress, 10 Brassicaceae species including A. thaliana and species closely related Arabidopsis were used. Of them, A. thaliana (Col-0) of moderately low-oxygen tolerant species, A. stelleri and R. islandica of highly low-oxygen tolerant species and Shandong ecotype of T. salsuginea of low-oxygen sensitive species were identified by comparison of physiological response to low-oxygen stress. To understand the different degree of low-oxygen tolerance at the molecular level, gene expression profiling using Operon Arabidopsis microarray was carried out at various time points of 0, 1, 3, 8, 24, and 72 h, in roots of A. stelleri, R. islandica, and Shandong ecotype of T. salsuginea under low-oxygen stress, and comparative analysis of gene expression profiles was carried out using GSEA with MapMan-based gene set database, including gene expression profiles of A. thaliana. In comparison of low-oxygen stress responses of four species, it was observed that each species distinctively reconfigures the energy metabolic pathways under low-oxygen stress. The results suggested that the degree of low-oxygen stress tolerance could be affected by the reconfiguration of the energy metabolic pathways during oxygen depletion, leading to an energy crisis. This study represents one of the most comprehensive analyses in studies conducted until now for investigating low-oxygen-responsive transcriptional networks in plant. Furthermore, the results in this study will provide valuable information of the regulatory network in low-oxygen stress response and contribute to produce low-oxygen tolerant plants.
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