Detection of Undeclared Milk Allergen in Processed Food using ELISA and Synthesis of a Possible Marker Peptide for LC/MS/MS

Abstract

Milk and dairy products are nutritious foods containing numerous essential nutrients. However, milk allergy is an immunological reaction to milk proteins and has been regarded as one of the most frequent food allergy in children under 2 years. In this study, food products that may contain undeclared milk or milk ingredients from local markets were analyzed using three commercial ELISA kits. The food samples to detect undeclared milk were selected based on food groups from Korean Food Standards. Because of possibility of false results of the ELISA, it is recommended to confirm peptides using LC/MS/MS. For LC/MS/MS it is required to synthesize marker peptide for confirmation of peptides from hydrolyzed milk protein with trypsin. The total number of food products analyzed in this study were 150 food products. Among the 150 food products, 20 products showed presence of undeclared milk, which was 13.3% of total food product. Undeclared milk was found in ‘Confectionaries (20%)’, ‘Cocoa Products or Chocolates (75%)’, ‘Coffees (20%)’, ‘Cereal Based Food for Infants and Young Children (100%, one item)’, ‘Curry (25%)’, ‘Wheat Flours (16.7%)’, and ‘Toasted Cereal Flakes (23.5%)’ groups. Most of undeclared milk products were found in 'Confectionaries (nine items)', 'Cocoa Products or Chocolates (three items)', and 'Toasted Cereal Flakes (four items)'. According to the possibility of false results of the ELISA, the marker peptide for LC/MS/MS was synthesized. Tryptic peptides from α-casein, β-casein, β-lactoglobulin, and α-lactalbumin had 26 peptides. Among 26 peptides, seven peptides represented high signal in MS analysis. After BLAST search, peptide LIVTQTMK from β-lactoglobulin exists only in cow milk. A peptide, LIVTQTMK was selected as a marker peptide to detect cow milk in food products. The purity of marker peptide, LIVTQTMK, of β-lactoglobulin was 97.772% and the mass was 933.0.;우유는 단백질과 지방, 미네랄, 그리고 비타민이 고루 풍부한 식품으로 치즈, 요거트 등 유제품의 주원료뿐만 아니라 식품첨가물로써 널리 사용되고 있다. 그러나 우유는 식품 알레르기 유발 원재료 중 하나로, 2세 미만의 아이들에게서 가장 많이 발생하는 우유 알레르기를 유발하는 물질이다. 본 연구는 국내 가공식품의 식품알레르기 표시 상황을 조사하고 국내 가공식품 중 우유 알레르기 미표시 제품을 모니터링 한 후 효소면역분석법인 ELISA를 이용하여 확인하였다. 또한 ELISA방법으로 진행한 실험의 결과를 LC/MS/MS를 통하여 재검증하기 위해 Marker peptide를 합성하고 합성된 펩타이드의 순도와 질량을 측정하였다. 본 연구에 활용된 상업적 ELISA kit는 Neogen사의 Veratox Total Milk kit, R-Biopahrm사의 RIDASCREEN® FAST Milk kit, 그리고 Morinaga사의 FOOD ELISA II Casein and β-lactoglobulin kit를 사용하였다. 본 실험은 우유 알레르기 미표시 국내 가공식품 중 우유 단백질을 포함할 수 있는 제품을 대상으로 진행하였다. 실험 대상은 식품공전의 식품 기준 및 규격을 참고하여 식품군으로 구분하였다. 국내 가공 식품 중 교차오염, 비의도적 혼입, 식품 알레르기 표시 미흡 등으로 인하여 우유를 포함할 가능성이 있는 제품을 선택하였다. 국내 가공식품 150개 제품을 대상으로 실험을 진행한 결과, 20개의 제품에서 우유 단백질이 검출되었으며, 이는 전체 실험 대상 중 13.3%에 해당한다. 미표시 우유 단백질이 발견된 식품군은 ‘과자류’, ‘코코아가공품류 또는 초콜릿류’, ‘커피’, ‘영ㆍ유아용 곡류조제식’, ‘카레’, ‘밀가루류’, ‘시리얼류’에서 검출되었다. 특히, ‘과자류’에서는 9개의 제품이, ‘코코아가공품류 또는 초콜릿류’에서는 3개의 제품이, ‘시리얼류’에서는 4개의 제품이 미표시 우유 단백질을 포함한 것으로 나타났다. ELISA는 위양성 결과가 나타날 가능성이 있기에 LC/MS/MS를 통하여 재검증하는 것이 필요하다고 생각하여, LC/MS/MS에 필요한 Marker peptide를 합성하고, 합성된 펩타이드의 순도와 질량을 측정하였다. Trypsin으로 우유 단백질을 분해하여 얻은 26개의 펩타이드를 대상으로 BLAST Search를 진행하였다. β-lactoglobulin의 펩타이드인 LIVTQTMK가 Cow milk에만 존재하는 펩타이드이므로 이를 Marker peptide로 선정하였다. Marker peptide로 LIVTQTMK를 합성하였으며, 합성된 Marker peptide의 순도는 97.772%이고, 질량은 933.0이다.