Detection and Molecular Mechanisms of Ertapenem Resistance in Enterobacteriaceae

Abstract

Determination of accurate susceptibility test and understanding of resistance mechanisms are important for treatment and infection control of ertapenem-resistant Enterobacteriaceae. We investigated detection of ertapenem resistance using different antimicrobial susceptibility tests, including the VITEK2, the MicroScan, Etest, disk diffusion test and broth microdilution (BMD), and molecular mechanisms of ertapenem resistance for ertapenem nonsusceptible Enterobacteriaceae isolates in a clinical microbiology laboratory at a tertiary university hospital. A total of 72 Enterobacteriaceae isolates were collected from the clinical microbiology laboratory of Ewha Womans University Mokdong Hospital, all of which were detected ertapenem resistance by the VITEK2 system; 43 (59.7%) Enterobacter spp., 13 (18.1%) Klebsiella pneumoniae, 8 (11.1%) Escherichia coli, 3 (4.2%) Citrobacter freundii, 2 (2.8%) Serratia marcescens and 3 (4.2%) others. Bacterial identification and antimicrobial susceptibility were determined using the VITEK2. Ertapenem susceptibility test was performed using the MicroScan, Etest and a disk diffusion test. Ertapenem susceptibility and minimum inhibitory concentrations (MICs) were confirmed by using BMD, and the results of different antimicrobial susceptibility testing methods were compared to those of BMD. Sensitivity, specificity, and positive- and negative-predictive values (PPV and NPV, respectively) of each method for detection of ertapenem resistance were calculated. Category agreement and essential agreement were assessed. Among the 72 isolates, 40 ertapenem nonsusceptibile isolates were selected for study of mechanisms of ertapenem resistance in Enterobacteriaceae. Carbapenemases and AmpC β-lactamase were screened using phenotypic methods. PCR and sequencing analysis were performed to detect carbapenemase, AmpC β-lactamase and extended-spectrum β-lactamase (ESBL) genes. Urea-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed to determine alteration of outer membrane proteins (OMPs). Molecular epidemiology investigated by using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) of XbaI-restricted genomic DNA. The isolates showed high resistance rates for almost β-lactams excluding carbapenems. For carbapenems, only two and one isolates were resistant to imipenem (2.8%) and meropenem (1.4%), respectively. Non-β-lactams including amikacin, gentamicin, trimethoprim/sulfamethoxazole and ciprofloxacin were relatively susceptible. Among the 72 isolates, 20 isolates (27.8%) were resistant and other 20 isolates (27.8%) were intermediate to ertapenem confirmed by BMD. The sensitivities for detection of ertapenem resistance of the MicroScan, Etest and disk diffusion test were 65.0%, 85.0% and 50.0%, respectively. The specificities for detection of ertapenem resistance of the MicroScan, Etest and disk diffusion test were 84.6%, 88.5% and 98.1%, respectively. Etest showed high sensitivity and specificity and excellent concordance with BMD. The disk diffusion test had the lowest sensitivity but the highest specificity. The essential agreements of the VITEK2, the MicroScan and Etest were 30.5%, 93.3% and 93.1%, respectively. The category agreements of the VITEK2, the MicroScan, Etest and disk diffusion test were 27.8%, 55.6%, 75.0% and 59.7%, respectively. The VITEK2 showed the lowest essential and categorical agreement with BMD. The MicroScan showed high essential agreement but low category agreement with BMD. Most category disagreements were minor errors. There were three very major errors in both the MicroScan and disk diffusion test. AmpC β-lactamases were found in 32 (80.0%) isolates of the 40 isolates with ertapenem nonsusceptibility; 24 isolates with blaMIR/ACT-like, 5 isolates with blaCMY-2-like and 4 isolates with blaDHA. ESBL genes were detected in 20 (50.0%) isolates; 13 isolates with blaCTX-M (9 CTX-M-1 group and 4 CTX-M-9 group), 10 isolates with blaSHV and 12 isolates with blaTEM. Distributions of β-lactamase genes were different among the species. One C. freundii isolate among the 40 isolates with ertapenem nonsusceptibility was positive for modified Hodge test, carbapenemase inhibition test and chromogenic agar, and blaIMP-1 associated class 1 integron was detected. SDS-PAGE of OMPs showed altered or greatly diminished expression of porins in all isolates of K. pneumoniae (n=5) and E. cloacae (n=11) with ertapenem resistance. Porin alterations were less common among the ertapenem intermediate isolates (4/19). Integration of the results of the molecular analysis of β-lactamases and the OMP analysis revealed that most of isolates with ertapenem resistance were associated with β-lactamase activity and porin alteration. The β-lactamses without porin alteration observed in most of the intermediate isolates. PFGE revealed most isolates were epidemiologically unrelated. The two of four isolates with same pulsotype had porin alteration and showed relatively high MICs of ertapenem compared to the other two isolates, suggesting that the ertapenem nonsusceptibility in Enterobacteriaceae might result from the accumulation of multiple carbapenem-resistance determinants in different isolates. The performance of the antimicrobial susceptibility testing methods to detect ertapenem resistance in Enterobacteriaceae was variable among the methods. Detection of ertapenem resistance in Enterobacteriaceae has limitations using routine testing such as an automated system or disk diffusion. Confirmation of results by an additional MIC test is recommended for accurate resistance results of ertapenem. Ertapenem resistance in clinical Enterobacteriaceae isolates was associated with β-lactamase activity and porin alteration. Even though carbapenemase-producing Enterobacteriaceae is still rare in Korea, continuous monitoring and infection control for carbapenem-resistant Enterobacteriaceae would be needed.;Ertapenem 내성 장내세균의 치료와 감염관리를 위해서는 정확한 항균제감수성 검사를 시행하고 내성 기전을 이해하는 것이 중요하다. 본 연구에서는, 대학병원의 임상미생물 검사실에서 분리되는 장내세균에서의 ertapenem 내성을 검출하기 위해 VITEK2, MicroScan, Etest, 디스크 확산법, 액체배지 미량희석법(broth microdilution method, BMD) 등의 다양한 항균제감수성시험 방법을 평가하였고, ertapenem 비감수성 균주에서의 분자유전학적 내성 기전을 밝히고자 하였다. 이화여자대학교 의과대학 목동병원 임상미생물검사실에서 VITEK2 시스템으로 검사하여 ertapenem 내성이 검출되었던 총 72주의 임상 균주를 수집하였다. 그 중 Enterobacter spp. 43주(59.7%), Klebsiella pneumoniae 13주(18.1%), Escherichia coli 8주(11.1%), Citrobacter freundii 3주(4.2%), Serratia marcescens 2주(2.8%), 기타 3주(4.2%)였다. VITEK2를 이용하여 균종 동정과 항균제감수성검사를 하였다. Ertapenem에 대한 항균제감수성을 MicroScan, Etest, 디스크 확산법으로 시행하였다. Ertapenem 항균제감수성과 MIC를 BMD로 확인하였고, 각 검사법의 결과를 BMD 결과와 비교하였다. Ertapenem 내성 검출에 대한 민감도, 특이도, 양성예측도와 음성예측도를 계산하였고, 감수성 해석 결과 간 일치도(category agreement)와 MIC 값 간의 일치도(essential agreement)를 구하였다. 72주 중 ertapenem에 비감수성인 40주에 대해 장내세균에서의 ertapenem 내성 기전에 대한 연구를 수행하였다. Carbapenemase와 AmpC β-lactamase는 표현형 검사로 선별하였다. Carbapenemase, AmpC β-lactamase, extended-spectrum β-lactamase (ESBL) 유전자를 검출하기 위해 중합효소 연쇄반응(PCR)과 염기서열분석을 시행하였다. 외막 단백질의 변형을 확인하기 위해 urea-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 시행하였다. 분자역학적 분석을 위해 XbaI 제한효소를 이용하여 pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)를 시행하였다. 균주들은 carbapenem을 제외한 대부분의 β-lactam 제제에 높은 내성률을 보였다. Carbapenem에 대해서는, imipenem과 meropenem에 대해 각각 2주(2.8%)와 1주(1.4%)만이 내성이었다. β-lactam 제제 외의 항균제인 amikacin, gentamicin, trimethoprim/ sulfamethoxazole, ciprofloxacin은 상대적으로 감수성이 높았다. 72 균주 중 20주(27.8%)가 BMD 결과 상 ertapenem에 내성이었고, 20주(27.8%)가 중간 내성이었다. Ertapenem 내성 검출에 대한 민감도는 MicroScan, Etest, 디스크 확산법이 각각 65.0%, 85.0%, 50.0%였다. Ertapenem 내성 검출에 대한 특이도는 MicroScan, Etest, 디스크 확산법이 각각 84.6%, 88.5%, 98.1%였다. Etest는 높은 민감도와 특이도를 보였고, BMD와 매우 잘 일치하였다. 디스크 확산법은 가장 낮은 민감도를 보였지만 특이도가 가장 높았다. VITEK2, MicroScan, Etest의 essential agreement는 각각 30.5%, 93.3%, 93.1%였다. VITEK2, MicroScan, Etest, 디스크 확산법의 category agreement는 각각 27.8%, 55.6%, 75.0%, 59.7%였다. VITEK2는 가장 낮은 일치도를 보였다. MicroScan은 essential agreement는 높았지만 category agreement는 낮았다. 대부분의 불일치는 minor error였고, MicroScan과 디스크 확산법에서 very major error가 3개씩 있었다. Ertapenem 비감수성인 40주 중 AmpC β-lactamase는 32주(80.0%)에서 검출되었다. blaMIR/ACT-like 유전자가 24주, blaMIR/ACT-like 유전자가 5주, blaDHA가 4주였다. ESBL 유전자는 20주(50.0%)에서 검출되었다. blaCTX-M이 13주(9 CTX-M-1 group, 4 CTX-M-9 group), blaSHV가 10주, blaTEM이 12주였다. β-lactamase의 검출 양상은 균종에 따라 다양하였다. Ertapenem 비감수성 균주 40주 중 C. freundii 1주가 Hodge 변법, carbapenemase 억제 시험과 발색배지에서 양성이었고, class 1 integron과 연관되어 있는 blaIMP-1이 검출되었다. 외막 단백질의 SDS-PAGE 결과, ertapenem에 내성인 K. pneumoniae 5주와 Enterobacter cloacae 11주 모두에서 porin의 발현이 현저히 감소하거나 변형된 양상을 볼 수 있었다. Ertapenem 중간내성인 균주들에서는 porin 변형이 덜 흔했다(4/19). β-lactamase의 분자유전학적 분석과 외막단백질 분석을 통합해 보았을 때, ertapenem 내성은 β-lactamase 활성과 porin의 변형과 관련 있는 것을 알 수 있었다. 대부분의 ertapenem 중간내성 균주에서는 porin 변화 없이 β-lactamase만 있었다. PFGE 결과에 따르면 대부분의 균주들이 역학적으로 연관성이 없었다. 같은 pulsotype에 속하는 4 균주 중 2주가 porin 변형이 있으면서 다른 2주보다 ertapenem MIC가 상대적으로 높았다. 이는 장내세균에서의 ertapenem 비감수성은 각기 다른 균주들이 다양한 carbapenem 내성 인자를 획득하여 축적함으로써 발생한다는 것을 뒷받침한다. 장내세균에서의 ertapenem 내성을 검출하는 능력은 다양한 방법 간에 차이가 있었다. 임상검사실에서 쓰는 검사법으로 장내세균에서의 ertapenem 내성을 검출하는 것에는 한계가 있었다. 정확한 ertapenem 내성 결과를 위해서는 추가적인 MIC 검사법으로 확인하는 것이 권고된다. 임상 장내세균 균주에서 ertapenem 내성은 β-lactamase 활성과 porin의 변형과 연관되어 있었다. 국내에서 carbapenemae 생성 장내세균은 아직 드문 것으로 나타났지만, carbapenem 내성 장내세균에 대한 지속적인 감시와 감염관리가 필요할 것이다.