Development of a Meningococcal Serum Bactericidal Assay Improved by an Overlay Agar Method with Coloring Colonies

Abstract

배경 수막구균은 토착성 또는 유행성으로 발생하는 침습성 세균 감염으로 높은 사망률과 치명율을 보인다. 그러나 이 균에 의한 침습성 감염병은 예방접종으로 예방할 수 있다. 예방접종으로 생기는 항체의 기능을 측정하는 방법은 혈청살상능 검사법이며, 그동안 많은 형태의 혈청살상능 기법이 개발되어 왔다. 이 연구는 기존의 혈청살상능 검사법에 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) 라는 착색제와 overlay agar를 이용하여 개선시킨 기법에 관한 것이다. 방법 대상 세균의 준비, 어린 토끼 혈청 보체의 농도, 반응 시간, TTC농도와 같은 다양한 실험 조건들을 최적화하였다. 초기 희석이 되어 있는 혈청을 준비하여 96-well microtiter plate에 연속적으로 3배수로 희석했다. 수막구균과 3~4주 된 어린 토끼 혈청을 모은 것을 함께 넣어준다. 그 후 microplate를 37℃, 5% 이산화탄소 환경에서 배양한다. 그 이후 10 μl의 반응 검체를 말 혈청이 첨가된 brain-heart-infusion 우무배지에 2cm의 길이로 흘린다. 배지에 액체 성분이 모두 흡수된 후 TTC를 넣은 BHI-HS agar (0.75%)를 위에 흘려 덮어준다(overlay agar). 착색된 콜로니의 수를 NICE라고 하는 자동 콜로니 측정 프로그램을 이용하여 세었다. 실험 조건들을 결정하고 성인 백신 접종자로부터 얻은 품질 관리 혈청을 이용하여 혈청군 A, C, W135, Y에 대하여 혈청살상능 검사의 재현성을 확인하였다. 결과 이 실험 결과 다양한 실험조건을 최적화하였다. 그리고 세균살상능 반응에 의해 살아남은 세균들의 배양 조건을 여러 변수에 대하여 비교하였다. Overlay agar와 TTC를 추가하는 방법은 혈청살상능의 역가에 영향을 미치지 않았다. 또한 TTC의 가장 적절한 농도는 25 mg/L로 확인되었다. 최종 콜로니의 측정은 착색되지 않은 콜로니를 육안으로 센 것과 콜로니 측정 프로그램을 이용한 것과 비교하였다. 자동 콜로니 측정 프로그램은 육안으로 측정한 것과 비교하여 보았을 때 높은 상관성을 보였다. 실험 내, 실험 간 재현성도 적합하였다. 결론 Agar overlay 방법은 연구자에 대한 생물학적 위해(biohazard)를 줄일 수 있다. Overlay에 TTC를 넣어 특별한 장비 없이도 높은 정확도와 효율로 배양된 콜로니를 확인 할 수 있었다. 이러한 착색 기법을 이용한 혈청살상능 기법은 수막구균의 면역반응을 확인하는데 있어 이전 방법들에 비해 더욱 안전하고 노력이 덜 드는 효과적인 방법이다.;Background Neisseria meningitidis is a cause of endemic and epidemic invasive bacterial disease and is associated with high morbidity. Immunization with vaccine protects individuals against invasive meningococcal disease. The serum bactericidal assay (SBA) is required to evaluate the functional activity of antibody produced in response to meningococcal vaccines. However, SBA is time consuming and labor intensive assay and hazardous due to handling large volume of meningococcus frequently and in large volume. In this study, the improved SBA by using a dye, 2, 3, 5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) with a solid overlay agar method was tried to develop and optimize the assay. Methods Variant assay parameters were optimized: target bacteria preparation, concentration of baby rabbit complement, assay incubation period and concentration of TTC. Prediluted test sera were prepared and serial 3-fold diluted in a 96-well plate. Meningococcus and a pool of sera from 3- to 4- week-old baby rabbit were added to each well. Then microplates were incubated at 37°C and 5% CO2 for determined optimal incubation time. Ten microliter of samples from each well was allowed to run down in 2-cm lanes on brain-heart-infusion with horse serum (BHI-HS) agar plate. Plate was overlaid with BHI-HS agar (0.75%) containing TTC. Colorized colonies were counted using colony counting software called NICE (NIST’s Integrated Colony Enumerator; National Institute of Standard and Technology, Gaithersburg, MD, U.S.A.). The selection of the assay parameters and the evaluation of reproducibility of serogroup A, C, W-135 and Y SBA were done with quality control sera from adult with vaccinated. Results Various parameters of assay were optimized. The growth of target cell survivor was compared under various conditions. Overlay agar method and addition of TTC were not influenced on serum bactericidal index. The concentration of optimal TTC was determined to be 25 mg/L. The accuracy of the colony counting method using software was compared to manual counting method. The automated counting program with using TTC was highly correlated with manual counting of non-colorized colonies. Inter- and intra-assay reproducibility was acceptable. Conclusion A solid agar overlay method reduced biohazards associated assay. Overlay agar with TTC permitted high-throughput and high resolution imaging of bacterial colonies grown on plates without special equipment. This new improved SBA allowed safe, easy and efficient evaluation to measure immune response to meningococcal vaccines.