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Studies on Structural Aspects of Various Peptides Employing FRET, PET and Photoisomerization Processes

Title
Studies on Structural Aspects of Various Peptides Employing FRET, PET and Photoisomerization Processes
Authors
이휘인
Issue Date
2015
Department/Major
대학원 화학·나노과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
이민영
Abstract
펩타이드 응집은 신경 병리학적인 질병을 야기하는 것으로 알려져 있다. 따라서 펩타이드의 응집 과정과 응집체를 확인하는 것은 질병 예방을 위한 첫 걸음이다. 형광 염료의 다양한 분광학적 특성은 여러 펩타이드의 구조적 측면을 확인하는 데 사용되어 왔다. 본 연구에서는 펩타이드 응집체의 구조적인 변화를 관찰하기 위해, 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 광유도 전자 전달 (PET) 그리고 광이성질화 반응 (Photoisimerization) 이 일어나는 특별한 형광 염료를 사용하였다. 이러한 염료의 특성은 자체 개발한 정적 형광 분석기기를 통한 형광의 측정과 시분해 단일 광자 상관 계수법 (time-correlated single photon counting; TCSPC) 을 이용한 형광 수명의 측정을 통하여 분석되었다. 먼저, 본 연구에서는 베타 아밀로이드 펩타이드 (Aβ) 의 응집을 확인하기 위해 FRET 현상을 관찰하였다. Pyrene은 엑시머 상태의 형광을 분석함으로써, 생체 분자들의 응집을 분석하는 데 널리 사용되어 왔다. Coumarin 6 (C6) 역시 아밀로이드 응집 저해인자로서 알려져 있다. 이 연구에서는 Py-Aβ와 C6간의 FRET 현상으로 일어나는 상대적인 형광 세기 비율의 변화를 측정함으로써 C6의 결합 친화력과 Aβ의 N-터미널에서 C6 결합 부위까지의 거리를 구할 수 있었다. 두 번째로, 본 연구에서는 여기 상태의 형광 염료와 타이로신 (Tyr) 사이의 PET 메커니즘을 밝히고자 하였다. Tyr은 분자간 PET를 확인할 수 있을 정도로 물에 충분히 녹지 않는다. 따라서 모델 펩타이드인 fluorophore-Ala-Gly-Gln-Tyr이 Loop 형태를 이룰 때, 여기된 fluorophore와 Tyr 사이의 분자 내 PET를 확인하였다. 이를 위해 ATTO465 (A465) 와 Tyr을 각각 전자 받개와 주개로 사용하였다. 모델 펩타이드의 형광 수명은 TCSPC에 의하여 측정되었으며 측정한 형광 수명을 통하여 PET 속도 상수를 구하였다. 얻어진 값은 pH에 관련된 함수로 나타내었다. 이를 통해 자유 에너지의 변화와 수소 커플링 전자 전달 (proton coupled electron transfer) 이라는 관점에서 결과를 해석할 수 있었다. 마지막으로, Thioflavin T (ThT)의 여기 상태의 동역학에 초점을 맞추어 인슐린 응집 연구를 수행하였다. ThT는 인슐린 응집체에 높은 결합 친화력을 가지며 주변 환경의 rigidity에 의존하는 분자로, 인슐린 응집체를 확인하는 데 유용한 외부 형광 염료이다. 본 실험에서, 인슐린의 구조 변화는 원자 힘 현미경 (AFM) 측정을 통해 배양 시간에 따라 관찰되었으며, 그 결과는 대조군으로 사용되었다. 그리고 인슐린 응집체와 결합한 ThT의 형광 수명은 시분해 상관 단일 광자 계수법과 형광 수명 이미징 현미경법 (Fluorescence lifetime imaging microscopy; FLIM)을 통하여 측정되었다. 이를 통해 ThT는 높은 분자량을 가진 응집체와 결합을 하며, 피브릴 응집체는 내부에 물 분자들을 함유하고 있는 것을 증명하였다. ;Peptide aggregation has been known to cause the neuropathologic diseases. Thus, it is important to understand the aggregation mechanism and to identify the aggregates for preventing the diseases. The various spectroscopic properties of dyes have been utilized to identify the structural aspects of various peptides. To investigate the conformational change of various peptides in this research, we used the specific dyes which involved fluorescence resonance energy transfer (FRET), photoinduced electron transfer (PET) and photoisomerization. These properties of dyes were analyzed by the measurement of steady-state fluorescence and fluorescence lifetimes through home-built two-channel spectrofluorometer and time correlated single photon counting (TCSPC) system, respectively. We firstly investigated the aggregation of amyloid-β (Aβ) by FRET. Pyrene has been widely used to detect the oligomerization of biomolecules through the measurement of excimer fluorescence. Also, Coumarin 6 (C6) has been known as an efficient inhibitor of amyloid aggregation. From the FRET between Py-Aβ and C6, we measured the relative emission ratio, calculating binding affinity of the C6 and the distance from N-terminal of Aβ to binding site. Secondly, we explored the PET reaction between excited fluorophore and tyrosine (Tyr). The fluorescence of an excited fluorophore is quenched by Tyr through electron transfer. However, the water solubility of Tyr is not high enough to observe the intermolecular PET. Thus, we prepared the model peptide, fluorophore-Ala-Gly-Gln-Tyr where the intramolecular PET is expected to occur between photoexcited fluorophore and Tyr at the closed loop formation. ATTO465 (A465) and Tyr were used as an electron acceptor and donor, respectively. The fluorescence lifetimes of model peptide were measured by using a time-correlated single photon counting (TCSPC) system and the PET rate constants were obtained from the measured fluorescence lifetimes. The values were presented as a function of pH. As a result, we explained our observation based on the change of free energy and proton coupled electron transfer. In addition, we focused on the excited state dynamics of Thioflavin T (ThT) which goes through the internal twisting motion between a benzothiazole ring and a dimethylaminobenzene ring. Also, ThT has been known to have a high binding affinity to insulin aggregates and as a molecular rotor depending on rigidity of microenvironment. It means that ThT is very useful extrinsic dye to identify insulin aggregates. We identified the conformational change of insulin as the elapse of the time by using AFM and the results were used as a reference. And we measured the fluorescence lifetimes of ThT bound to insulin aggregates by using a TCSPC and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Our results described that ThT bound to high molecular weighted aggregates and the fibril aggregates confined the water molecules.
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