Identification of novel protein transduction domain derived from translationally controlled tumor protein

Abstract

지금까지 단백질을 사용한 치료법의 가장 큰 어려움으로 지적되어 온 사항은 단백질 약물이 크기 때문에 세포막을 제대로 통과하지 못한다는 것이었다. 단백질 전달체인 PTD (Protein Transduction Domain)는 세포 밖의 물질을 세포 안으로 전달해 주는 물질 전달 펩타이드로써, 세포 내에서 효과를 내는 단백질이나 크기가 큰 화학물질들이 세포 안으로 침투하는 것을 도와주는 역할을 한다. 즉, 세포내로의 전달이 어려웠던 Protein, DNA, 펩타이드 또는 거대 화학물질 등을 효과적으로 세포 내로 전달시키는 기능을 가진 물질 전달 펩타이드를 말한다. 세포막투과 펩타이드에 대한 연구의 시작은 1965년에 polylysine 또는 다른 양이온으로 이루어진 거대분자와 특정 단백질을 섞어주면 세포내로 단백질의 이동을 증가시킬 수 있다는 보고였다. 더 최근에는 human immunodeficiency virus type 1 (HIV 1)에서 유래한 Tat 단백질이 세포내로 이동한다고 보고되었다. 그 후 Drosophila 전사인자인 Antennapedia의 homeodomain이 세포막을 투과하는 능력이 있고, 이 중 세포막을 투과하는 역할을 하는 특정 짧은 서열이 존재한다는 것을 밝혔다. 그 후 단백질에서 유래 (예; pVEC, VP22), chimera에서 유래 (예; transportan), 완전 합성물에서 유래 (예; amphipatic 펩타이드, MAPs, 또는 oligoarginine)한 것 등 많은 펩타이드가 세포막을 통과한다고 보고되었다. 이들 사이에 서열과 구조적인 공통점을 보면, 양성의 아미노산으로 구성되어 있거나, α\-helix 구조를 갖거나, 양친매성 (amphipathic) 펩타이드이거나, proline이 많은 서열 등이다. 이러한 PTD의 세포막 투과 능력은 receptor-mediated endocytosis나 direct penetration에 의한 세포막 투과현상이지만 그 원리가 아직 명확히 규명되지 않았다. 또한 PTD는 Cargo 물질 (Protein 및 DNA 등)을 세포내로 전달하는 기능뿐 아니라 다양한 투여경로에 의하여 조직침투능이 있어 cargo 물질을 피부, 인후점막, 안구 등을 통하여 몸의 필요한 부위로 전달하는 기능도 가지고 있고, BBB (Blood Brain Barrier, 뇌혈액관문)도 통과하여 뇌에도 필요한 생리활성조절물질을 전달할 수 있게 하여 준다. 본 연구에서는 TCTP 단백질이 세포막을 침투할 수 있다는 것을 발견하였고 PTD 기능을 하는 도메인을 찾았다. 이는 TCTP 아미노 말단의 10개의 아미노산 서열로 이전에 보고되었던 PTD와는 유사하지 않은 서열의 구조로 이루어져있으며 소수성이 강한 성질을 가지고 있다. TCTP (1-10) 은 펩타이드 형태로도 세포에 농도의존적으로 들어가며, 또한 120 kDa의 beta-galactosidase와의 융합단백질 형태로도 농도 의존적으로 세포막을 통과한다. 이 융합단백질은 mice에 복강 주사하면, 주요 6종 조직에 모두 침투하며, 특히 뇌에도 침투하는 것으로 보아 BBB를 통과할 수 있는 기능이 있다. 또한 TCTP-PTD의 세포막 투과 경로에 대한 연구도 이루어졌다. 세포막을 투과하는 기전은 세포막과의 결합과정, 결합 후 세포내로의 이동이라는 두 단계로 이루어진다. TCTP-PTD의 경우 세포막 결합 과정이 TAT과는 다르게 세포 외부에 있는 proteoglycan인 heparan sulfate와 결합하지 않는다. 세포막과 결합 후에는 에너지 의존적으로 세포내로 이동되고, 특히 lipid raft-mediated endocytosis 과정을 통해 세포내로 이동되고, 부가적으로 macropinocytosis과정도 관여한다. 본 연구에서는 또한 TCTP-PTD가 adenovirus의 delivery를 증가시킬 수 있는지를 세포와 mice에서 확인하였다. TCTP-PTD peptide와 GFP를 발현하는 adenovirus의 복합체를 세포에 infection하면 GFP 발현 정도가 TCTP-PTD에 의해 증가된다. 또한 호흡기 감염의 원인이 되는 RSV의 항원에 대한 adenoviral vaccination의 분야에서, RSV의 주된 당단백질인 G protein 을 발현하는 adenovirus와 TCTP-PTD의 복합체를 만들어 세포에 감염시키면 G protein의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 이를 마우스에 비강내 감염시키면 2주 후에 total serum에서 RSV-specific IgG와 lung BALF에서 RSV-specific IgA의 증가를 확인하였다. 본 논문은 TCTP에 PTD부분을 mapping 하였고, PTD로서 기능할 수 있는지 확인하여, TCTP-PTD는 drug delivery분야에서 새로운 전달체로서의 가능성이 있을 것으로 사료된다.;The successful application of systemic non-viral therapies to treat human disease is still limited because of plasma membrane…s impermeability to macromolecule and polar molecules. However, elegant delivery system using protein transduction domain (PTD) was recently developed due to its cell penetrating ability. Although human translationally controlled tumor protein (TCTP) has no consensus sequences with a plenty of well-known PTDs, our lab found that extracellular TCTP can enter the cells. Here, I report that small hydrophobic peptide, derived from amino terminus of TCTP, can translocate the cell and tissue interior and is applicable to adenoviral gene delivery. TCTP-PTD revealed unique sequences with high hydrophobicity, which differ from well-known PTDs. TCTP-PTD peptide labeled with fluorescence dye as well as fusion protein conjugated with 120 kDa of beta-galactosidase, can efficiently transduce the cells. Intraperitoneal injection of beta-galactosidase fused with TCTP-PTD results in efficient delivery to major tissues of mice, including the liver, kidney, spleen, lung, heart and brain, indicating that TCTP-PTD can deliver a large protein into various tissues and even across the blood-brain barrier (BBB). Initial membrane binding step of TCTP-PTD do not require heparan sulfate, most of TCTP-PTD do not enter lysosome and nucleus, and it is most likely that internalization mechanism of TCTP-PTD includes energy-dependent, lipid raft-dependent endocytosis and macropinocytosis, according to the inhibitor experiments. In application experiments, preincubation of TCTP-PTD with adenovirus increases adenoviral mediated-gene expression in cells and improves immune response in vivo, induced by intranasal administration of adenovirus expressing the triple repeat of G glycoprotein of respiratory syncytial virus (RSV), Ad-3×eG. These results suggest that TCTP-PTD is a novel cell penetrating peptide and has important potential as a tool for the delivery of therapeutic agents.