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CISPLATIN INDUCES OVER ACTIVATION OF THE DORMANT PRIMORDIAL FOLLICLE THROUGH PTEN/AKT/FOXO3a PATHWAY WHICH LEADS TO LOSS OF OVARIAN RESERVE IN MICE

Title
CISPLATIN INDUCES OVER ACTIVATION OF THE DORMANT PRIMORDIAL FOLLICLE THROUGH PTEN/AKT/FOXO3a PATHWAY WHICH LEADS TO LOSS OF OVARIAN RESERVE IN MICE
Other Titles
생쥐에서 항암제 시스플라틴에 의하여 유발된 조기 난소 부전의 기전 규명을 위한 PTEN/Akt/PI3K 경로 활성화 연구
Authors
장은미
Issue Date
2014
Department/Major
대학원 의학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
정경아
Abstract
Objective: While fate of ovarian failure after chemotherapy has been well established, the precise mechanism by which this occurs is not clear. Recent study has revealed that PTEN/Akt/FOXO3 signaling in oocytes is critically important for maintenance of the primordial follicle pool. Current study was designed to investigate role of this pathway in cisplatin induced primordial follicle depletion. Materials and Methods: This was an experimental study using animal model. Mice was given daily intraperitoneal injection of cisplatin 2 mg/kg (Dong A Pharmaceutical, Korea) for 15days. Ovaries were collected at time point 0, 5, 10, 12 and 15 days after the start of daily cisplatin injection. Ovaries were fixed in paraformaldehyde (PFA) and paraffin embedded. Serially sectioned (5 μm section) ovarian tissues were stained with hematoxylin for differential follicle count. Early stage follicles were counted according to previous definitions after staining with the early-stage ovarian follicle marker LIM Homeobox 8 (Lhx8). Ovary samples were used for immunohistochemistry and evaluated for apoptosis using the Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay. Antibodies used in western blotting were PTEN, Akt, phospho-Akt, ERK, phospho-ERK, GSK3-β, phospho-GSK3-β and FOXO3a with visualization by enzymatic chemiluminescence. Results: Quantification of the different follicle populations at each time point after cisplatin injection showed that follicles beyond antral stage lapsed most rapidly after cisplatin injection and as the cumulative dose of cisplatin increase, there was 14.6 fold increase in ratio of growing follicles (primary and secondary) to dormant follicles (primordial follicle). As with the TUNEL staining, apoptosis was mainly observed in granulosa cells of growing or mature follicle until day 10 and relatively few primordial follicles were stained compared to growing and mature follicles at day 15. Analysis of the PTEN/Akt/FOXO3 pathway demonstrated a decreased in PTEN and subsequent phosphorylation of key molecules involved in the pathway as the cumulative dose of cisplatin increased. Activation of the pathway cascade resulted in an increased cytoplasmic translocation of FOXO3a in cisplatin-treated follicles. Conclusions: Cisplatin over-activated the dormant primordial follicles in mice, resulting in the loss of a resting pool of ovarian follicles. Cisplatin treatment activate the PTEN/Akt/FOXO3a pathway, increasing the growing follicle pool and rapidly depleting the dormant follicles. Our finding suggests that modulation of PTEN/Akt/FOXO3a pathway might be a promising target to preserve fertility during cisplatin treatment.;연구 목적: 항암제의 사용이 난소 조기 부전과 밀접한 연관성을 갖는다는 사실은 이전 여러 연구에서 알려져 있지만 현재까지 그 기전은 현재까지 뚜렷하게 밝혀지지 않았다. 최근의 한 연구에서 원시 난포 세포 비축량 유지에 있어 PTEN/Akt/FOXO3 활성화 경로가 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려졌다. 따라서 본 연구는 이 경로와 시스플라틴에 의하여 유발되는 원시난포세포의 고갈 현상과의 연관성을 알아보기 위해 시행되었다. 연구 재료 및 방법: 본 연구는 동물 모델을 이용한 실험연구로 진행되었다. 생쥐를 이용하여 15일 동안 매일 시스플라틴을 0.5, 1, 1.5 그리고 2 mg/kg 농도로 복강 내로 주입하였고 이후 0, 5, 10, 12 그리고 15일째 난소를 채집하였다. 채집된 난소는 PFA 와 파라핀에 넣어 고정하였고 5 μm 두께로 연속 절단 후 헤마톡실린 염색을 시행하여 난포 단계별 수와 모양을 관찰하였다. 원시난포세포의 경우 초기 난포세포의 난자에 염색되는 Lhx 8를 면역염색하여 정확한 집계를 시행 하였다. 난포의 사멸 기전을 보기 위해 TUNEL 검사를 시행하였으며 PTEN/Akt/FOXO3 경로의 활성화 여부를 보기 위해 PTEN, Akt, phospho-Akt, ERK, phospho-ERK, GSK3-β, phospho-GSK3-β 와 FOXO3a 면역항체를 이용한 western blotting 및 면역형광염색을 시행 하였다. 결과: 시스플라틴 주입 이후 각 시점에 난소를 채집하고 난포의 수를 각 단계별로 정량한 결과 항암제 유발 조기 난소 부전의 모델은 2mg/kg군이 적합했으며 이 군에서 시스플라틴의 누적 용량이 증가함에 따라 휴면기에 있는 원시난포세포에 비해 활성화된 난포의 비율이 증가함을 관찰 할 수 있었다. TUNEL 염색 소견에서는 세포사멸은 시스플라틴 주입10일 까지는 주로 배란기의 완숙 난포나 황체의 과립막 세포에서만 관찰 되었고 10일 이후에는 주로 일차 및 이차 난포세포에서 관찰되었다. 모든 시점에서 원시난포세포의 사멸은 뚜렷하게 관찰되지 않았다. 단백질 분석에 있어서는 시스플라틴의 누적 주입량이 증가할수록 PTEN 단백질의 양이 감소하고 PTEN/Akt/FOXO3 기전이 활성화 되며 FOXO3a 가 핵에서 세포질로 이동하는 것이 관찰되었다. 결론: 본 연구에서는 시스플라틴이 휴면기의 원시난포세포의 활성화를 유도하여 원시난포세포의 소멸을 유도한다는 것을 증명하였다. 시스플라틴을 주입한 결과 PTEN/Akt/PI3K/FOXO3 기전이 활성화 되었으며 원시난포세포 및 동난포 이상의 성숙된 난포가 급격한 감소를 보이는 반면에 일차 난포 및 이차 난포는 상대적인 증가를 보였다. 본 연구 결과는 추후 항암제 치료 이후에 유발되는 조기 난소 부전을 예방할 수 있는 유망한 표적 치료의 가능성을 보여준다.
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일반대학원 > 의학과 > Theses_Ph.D
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