Mass spectrometry-based metabolic profiling of serum in N-methyl-N-nitrosourea-induced rat mammary tumor model treated with leaf essential oils of Chamaecyparis obtusa ENDL

Abstract

본 연구에서는 국내 자생 방향식물인 편백나무 잎 정유의 유방암 치료효능을 탐색하기 위하여 mass spectrometry (MS)를 기반으로 하는 metabolomics 연구기법을 수행하였다. 편백나무 잎은 2013 년도 4 월에 전라남도 장성군에 위치한 축령산에서 채집하였다. 채집한 편백나무 잎의 정유는 전라남도 나주시에 위치한 농촌진흥청의 수증기 증류장치를 이용하여 추출하였다. N-methyl-N-nitrosourea (NMU) 로 유방암이 유도된 SD Rat 모델에 추출한 편백나무 잎 정유를 그룹별로 농도를 달리하여 8 주 동안 경구 투여하였다 (5 mg/kg body weight, 20 mg/kg body weight). 8 주간 편백나무 잎 정유를 투여했던 동물생체시료 (serum) 내의 1 차 대사산물 프로파일링은 Gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF-MS) 을 통해 수행하였으며 다변량 통계기법인 PLS-DA 를 이용해 그룹 내 판별 분석을 실시하였다. Target analysis 방법을 이용하여 생체시료 (serum) 내 총 42 가지의 1 차 대사산물을 동정하였으며 11 가지의 당류, 10 가지의 지방류, 6 가지의 유기산류, 15 가지의 아미노산류가 확인되었다. 유방암 발현 그룹과 건강한 대조군 간의 대사적 변화의 차이를 통해 D-erythrotetrafuramose (Erf), D-(+)-maltose (Mal), propanoic caid (PA), glycine (Gly) 이 바이오마커 (possible biomarkers) 로 확인되었다. 이를 바탕으로 유방암 발현 그룹과 유방암 유도 후 편백나무 잎 정유를 농도를 달리하여 투여한 그룹 간의 대사적 변화를 확인하였다. Gly 를 통해서 유방암 발현 그룹과 유방암 유도 후 편백나무 잎 정유를 투여한 그룹 간의 차이를 확인 할 수 있었다. 그러나 바이오마커들을 통해서는 편백나무 잎 정유 농도에 따른 대사적 차이를 뚜렷하게 확인할 수 없었다. 4 주차와 8 주차 각각 수행한 PLS-DA 분석에 따르면, 4 주차, 8 주차 모두 20 mg/kg body weight 농도의 편백나무 잎 정유를 투여한 그룹이 건강한 그룹과 가까운 것을 확인할 수 있었다. 이들 구분에 관여하는 주요 대사체들로는 4 주차에서는 Thr, PA, Gla, Min, Pen, Doc, Gly, EtA, CA, OA, Ser, Erf, Pro 였고 8 주차에서는 PA, Glm, Glu, OA, Doc, Gla, Par, Ara, SA, Gly, Crn 이었다. 한편, 편백나무 잎 정유는 Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) 를 이용하여 분석하였으며, 총 126 가지의 방향성분을 동정하였다. 주요 구성성분은 monoterpene hydrocarbons (33.55 %) 와 oxygenated monoterpenes (24.73%) 이었다. 편백나무 잎 정유에서 상대적 정량치가 비교적 높게 동정되고 선행연구를 통해 암 억제 효과가 보고된 terpene 류는 sabinene, (R)-(+)-limonene, β-myrcene, bornyl acetate, cis-thujopsene, elemol, and β-eudesmol 이었다.;To evaluate the effects of leaf essential oil of Chamaecyparis obtusa ENDL., on the breast cancer growth, the metabolic profiling of serum obtained from NMU-induced rat mammary tumor model dosing the different concentrations (5 mg/kg body weight, 20 mg/kg body weight) of its leaf essential oil for 8 weeks was determined using GC-TOF-MS combined by multivariate statistical analysis, partial least square discriminant analysis (PLS-DA). A total of 42 metabolites, including 11 carbohydrates, 6 organic acids, 10 lipids, and 15 amino acids, were identified in blood serums of rat studied. The alteration of some possible bi-omarkers detected in this study showed that the metabolic changes in serum be-tween healthy controls and breast cancer groups. D-Erythrotetrafuranose (Erf), D-(+)-Maltose (Mal), propanoic acid (PA), and glycine (Gly) were detected as possi-ble biomarkers by evaluating the metabolic changes in serum. Among them, Gly level showed that there were significant differences between mammary tumor rats and those treated leaf essential oil. At 4 weeks, a classification of 20 mg/kg body weight of C. obtusa essential oil treated groups was close to that of healthy groups in distance. The important metabolites associated with the separation, were L-threonine , propanoic acid, L-glutamic acid, myo-inositol, pentane-1,5-diamine, dodecane, glycine, (5Z,8Z,11Z,14Z)-5,8,11,14-eicosatetraenoic acid, citric acid, oxalic acid, L-serine, D-erythrotetrafuranose and L-proline. At 8 weeks, a distance between a classification of 20 mg/kg body weight of C. obtusa essential oil treated groups and that of healthy groups were also near. The major metabolites for sepa-rations, included propanoic acid, L-glutamine, D-(+)-glucose, oxalic acid, dodec-ane, L-glutamic acid, parabanic acid, arabitol, succinic acid, glycine and creatinine. In addition, when the leaf essential oils of C. obtusa were analyzed using GC-MS, a total of 126 volatiles were identified in the leaf essential oil. The predominant volatiles in the leaf essential oil of C. obtusa were sabinene (13.02 %), (R)-(+)-limonene (5.19 %), β-myrcene (3.95 %), bornyl acetate (6.27 %), cis-thujopsene (3.90 %), elemol (9.35 %), and β-eudesmol (3.55%).