Comparison of Chondrogenesis of Tonsil-derived Mesenchymal Stem Cells in 2D and 3D culture conditions

Abstract

Methoxy-Poly(ethylene glycol)-b-poly(L-alanine) (mPEG-L-PA)s with molecular weights 2000-1560 were synthesized to investigate their potential as a three-dimensional (3D) culture matrix of tonsil-derived mesenchymal stem cells (TMSCs). The sol-to-gel transition temperature and modulus on sol-gel state has been measured. TMSCs were cultured in the 3D matrixes of in situ formed mPEG-L-PA hydrogels in absence or presence of growth factors, which were produced by increasing the temperature of cell-suspended mPEG-L-PA aqueous solutions. The spherical morphology was maintained in the mPEG-L-PA hydrogel without growth factors, while the cells underwent increased cell size in the exogenous growth factors over 14-28 days of incubation. TMSCs exhibited high mRNA expression of chondrogenic differentiation markers such as type II collagen, aggrecan, and SOX9 in the mPEG-L-PA thermogel without growth factors as well as more early expressed than 2D cultures whereas chondrogenic hypertrophic maker type X collagen was highly expressed in the presence of growth factors. Similar to the mRNA expression, the mPEG-L-PA thermogel encapsulated TMSCs without growth factors predominantly exhibited glycosaminoglycans and type II collagen expression as the chondrogenic biomarkers by alcian blue and immunofluorescence staining, respectively. The chondrgenic and hypertrophic differentiation of mPEG-L-PA thermogel encapsulated TMSCs may be regulated by biological and physical cues such as growth factors and gel modulus. This study suggests that the polypeptide thermogel of mPEG-L-PA is promising as a 3D culture matrix of TMSCs for chondrogenesis and as an injectable tissue engineering biomaterial.;본 연구에서는 온도가 증가함에 따라 졸-젤 전이를 보이는 이중 블록 공중합체인 폴리 (에틸렌 글라이콜)-L-폴리알라닌을 합성하여 편도유래 줄기세포를 3차원으로 배양하여 줄기세포의 증식과 분화에 어떠한 영향을 주는지 연구하였다. 2차원으로도 배양하여 3차원 배양과의 차이점을 비교하였다. 폴리 (에틸렌 글라이콜)의 분자량의 2000달통이고 L-폴리알라닌의 분자량은 1560달톤으로 고정하였다. 용액상에서 고분자는 농도가 증가함에 따라 졸-젤 전이 온도가 낮아졌다. 점도측정기로 탄성도를 측정하여 3차원 배양에 적당한 농도를 찾았다. 세포 실험군은 젤에 편도줄기 세포만 넣은 것, 젤에 편도줄기세포와 성장촉진인자를 넣어준 것, 그리고 양성 대조군으로 성장촉진인자를 넣어주고 2차원 배양한 것으로 세웠다. RNA 발현으로는 연골과 골연골의 지표들을 보았다. 첫 째 군에서는 연골세포로 제일 잘 분화가 된 것으로 보였고 둘째 군에서는 골연골 세포로 제일 많이 갔음을 알 수 있었다. 염색법을 통해 본 세포의 형태와 단백질 발현은 2차원 배양보다 3차원 배양에서 더 연골세포의 형태를 지니고 단백질 발현도 3차원 배양이 2차원 못지않게 우수함을 보였다. 이 실험을 통해 온도민감성 수화젤이 편도유래 줄기세포의 3차원 배양을 통해 연골을 만드는 조직 공학적 시스템으로서의 가능성을 볼 수 있었다.