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Characterization of BTB-ZF transcription factor, BZEL

Title
Characterization of BTB-ZF transcription factor, BZEL
Authors
남어리
Issue Date
2012
Department/Major
대학원 생명·약학부생명과학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
윤영대
Abstract
BTB-ZF(BTB domain-containing zinc finger) protein family consists of about 43 members in mouse and human and usually acts as transcriptional repressors. Previously, several members were shown to play crucial roles in development and function of hematopoietic cells, especially in B and T lymphocytes. Here, I report the identification and characterization of a novel BTB-ZF protein specifically expressed in effector T/B lymphocytes and named as BZEL (BTB-ZF protein expressed in effector lymphocytes). This thesis is divided into 3 parts and the summary of each part is described below. Part I : Upon screening for the BTB-ZF proteins expressed in mouse memory T cells by degenerate PCR using primers based on the conserved sequence of the BTB domain, a novel gene, zbtb46 was identified. Zbtb46 encodes a BTB-ZF protein named as BZEL. The expression of BZEL is restricted in secondary lymphoid organs and especially elevated in effector T/B lymphocytes. In addition, BZEL acts as a sequence-specific transcriptional repressor through binding with corepressor complex components such as HDACs and NcoR. Moreover, the subcellular localization and transcriptional activities of BZEL are regulated by post-translational modifications such as sumoylation and phosphorylation. Part II : In this thesis, I tested whether BZEL acted as a transcriptional repressor of p53 gene in germinal center B cells. Upon expression of BZEL, p53 promoter-driven reporter activity was suppressed and BZEL bound directly to -3.0~-2.5 kbp of p53 promoter region. In addition, p53-dependent apoptosis induced by DSB response was repressed by the overexpression of BZEL in B cells. These results indicate that BZEL suppresses transcription of p53 gene in germinal center B cells and lead me to test the possibility whether BZEL overexpressing-transgenic mice develop lymphoma. At 24 months, BZEL-transgenic mice displayed the spontaneous development of DLBCL type lymphoma Developed lymphomas were positive for B220 and Bcl6 expression, indicating these lymphomas were GC-B cell-derived. Taken together, these results suggest that in germinal center B cells BZEL mediates anti-apoptotic signaling pathway by regulating transcription of p53 and aberrant BZEL regulation may lead to the development of lymphoma. Part III : Meanwhile, other member in the lab demonstrated that BZEL mediates targeting of AID to Ig locus during SHM process in germinal center B cells and is required for SHM processes. Since the targeting of AID to Ig locus is required for both SHM and CSR, I tested whether BZEL is required for CSR. BZEL bound to cis-elements required for CSR such as switch regions, Eμ enhancers and 3’ regulatory regions. Moreover, the frequency of class switch recombination was reduced by the introduction of BZEL-specific shRNAs. Taken together, these results show that BZEL is required for CSR process in germinal center B cells.;BTB-ZF family는 인간 유전자에서 약 43개의 단백질들로 구성되어있고 진화적으로 보존된 단백질 family이면서 주로 전사 억제 과정과 연계되어 있다. 지금까지 BTB-ZF family의 구성 단백질들에 대한 연구가 많이 이루어져 왔고 혈액세포, 그 중에서도 B 임파구와 T 임파구의 발달과 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 논문에서는 effector T/B 임파구에서 발현이 증가되어 있는 새로운 BTB-ZF 단백질을 규명하였고 이름을 BZEL(BTB-ZF protein expressed in effector lymphocytes)이라 명명하였다. 본 논문은 3개의 부분으로 나뉘며 각 부분들에 대한 요약은 다음과 같다. Part I : 본 연구실에서는 BTB-ZF family 단백질간에 보존된 BTB domain을 대상으로 primer를 제작 후 degenerate PCR을 수행하여 mouse memory T 임파구에서 발현되는 BTB-ZF 단백질을 screening 함으로써 기능이 알려지지 않은 BTB-ZF 단백질인 zbtb46 유전자의 발현을 확인하였고 이 단백질을 BZEL이라고 이름 붙였다. BZEL은 특이적으로 secondary lymphoid organ에서 발현이 제한되어 있으면서 특히 effector T/B 임파구에서 발현이 증가되어 있다. 또한, BZEL은 consensus 결합부위를 가지고 있으면서 HDACs과 NcoR과 같은 corepressor complex의 구성요소들과 결합하여 전사 억제 인자로서 작용을 한다는 것을 확인하였다. 게다가, BZEL 단백질은 in vivo에서 sumolyation과 phosphorylation이 일어나는데 BZEL의 세포 내에서의 위치와 전사 인자로서의 작용이 이러한 post-translational modification에 의해 조절된다. BZEL은 또한 보존된 phospho-sumoyl switch 아미노산 서열을 가지고 있고 BZEL 단백질의 Ser234번에서의 phosphorylation은 Lys229번에서의 sumoylation이 되는데 필수적임을 확인하였다. 특히, sumoylation 또는 phosphorylation site 아미노산이 결여된 mutant BZEL은 blimp-1 promoter에 의한 luciferase 활성을 억제하는 능력과 plasmablast로의 분화를 유도하는 능력을 잃게 되는 것을 확인하였다. 또한 BZEL의 sumoylation은 ATM에 의한 DSBs(double strand breaks) 반응에 의해 증가한다. Part II : T 임파구 의존적인 면역 반응 동안에는 특성화된 follicule의 구조인 germinal center(GC)가 항원에 의해 활성화된 B 임파구들에 의해 형성이 된다. 활성화된 B 세포는 Germinal center에서 clonal expansion과 genomic DNA remodeling과정인 somatic hypermutation(SHM)과 class switch recombination(CSR)을 겪게 되고 항체를 분비할 수 있는 plasma 세포나 memory B 세포로 분화가 된다. 이러한 GC-reaction 과정들이 적절히 조절되지 않으면 transformed 악성 종양이 생기거나 자가 면역질환이 발병할 수 있기 때문에 다양한 조절 기작들이 정교하게 GC-reaction을 조절하고 있으며 특히, Bcl6과 Bach2, IRF8과 같은 전사인자들이 이러한 과정에 참여하고 있다. 그 중에, Bcl6는 대표적인 BTB-ZF family에 속하는 단백질로써 germinal center 형성의 주요한 조절인자로 알려져 있다. 또한 Bcl6는 p53과 blimp-1 유전자의 전사를 억제 함으로써 germinal center B 세포의 분화를 조절한다고 알려져 있다. BZEL 단백질의 발현이 Bcl6처럼 germinal center B 세포에서 증가되어 있기 때문에 BZEL도 germinal center B 임파구에서 p53 유전자에 대해서 전사 억제 인자로 작용하는지 여부를 검증해보았다. 그 결과 BZEL 단백질을 발현 할 수 있는 plasmid를 transfection한 세포에서 p53 promoter-driven reporter의 작용이 억제되고 BZEL이 p53 promoter의 -3.0~-2.5kp 부분에 직접적으로 결합을 하는 것을 확인하였다. 또한 BZEL을 과발현 시킨 B 세포에서 DSB(double strand break)반응에 의한 p53 의존적인 세포 사멸과정이 억제되는 것을 확인하였고 이러한 결과들은 BZEL이 germinal center B 세포에서 p53의 전사를 조절한다는 사실을 보여준다. 이와 같이 BZEL이 p53의 전사를 조절한다는 것을 바탕으로, 나는 BZEL을 과발현 시킨 유전자 변형(transgenic) mice에서 림프종이 발병 할 가능성을 시험 해 보았다. BZEL-transgenic mice는 T/B 임파구에서 정상적인 발달과 effector 기능을 보였다. 그러나 약 24 개월 째 BZEL-transgenic mice에서 자발적으로 DLBCL(diffuse large B cell lymphoma) 타입의 림프종이 발병되었다. 이러한 BZEL-transgenic mice에서의 림프종에서는 B220과 Bcl6단백질의 발현을 확인할 수 있었는데 이는 림프종 세포 기원(origin)이 GC(geriminal center) 유래의 B 임파구임을 나타내는 것이다. 또한 림프종 조직은 proliferarion의 marker인 Ki-67 단백질에 대해서도 그 발현이 증가되어있는 것을 확인하였다. 결론적으로, 이러한 결과는 BZEL이 p53의 전사를 억제함으로써 germinal center B 세포에서 세포사멸을 억제하는 신호 전달과정을 조절하고 비정상적인 BZEL의 발현은 림프종 형성에 영향을 미칠 것이라는 사실을 뒷받침한다. Part III : 본 실험실에서는 germinal center B 세포에서 SHM 과정 동안 BZEL이AID(activation-induced deaminase)의 targeting을 조절한다는 것을 밝힌 바가 있었다. 또한 BZEL이 Igκ chain 유전자의 enhancer 부분에 결합하고 AID와의 직접적인 결합을 통해서 Igκ 유전자에 AID를 끌어들인다는 것을 확인하였다. 더불어 BZEL유전자가 제거된 BZEL-/- DT40 세포주에서 somatic hypermutation(SHM) 과정이 심하게 결여되어 있는 것을 확인했고 이는 BZEL이 SHM 과정에 필요하다는 것을 나타낸다. 한편 Class switching 과정은 Cδ를 제외하고 각 CH 유전자의 upstream에 위치한 반복적인 1-12kb 크기의 switch DNA 부분에서 일어나는 intrachromosomal rearrangement 작용을 수반한다. 이러한 immunoglobulin heavy chain에서 class switch recombination(CSR) 과정은 switch region에서 DNA DSB(double strand break) 과정을 동반한다. CSR 동안 AID는 repetitive switch 염기 서열에서 DSB를 유도하는 데 필요하다. 현재까지 AID가 switch regions 특이적으로 targeting되는 기작은 아직 잘 알려져 있지 않다. Ig 유전자 locus로의 AID의 targeting은 SHM과 CSR 두 과정 모두 필요로 하는 단계이기 때문에 이러한 결과는 BZEL 단백질이 CSR 과정에도 필요할 가능성을 나타낸다. 이러한 이유로 나는 BZEL이 mouse의 IgH 유전자에 있는 switch regions이나 Eμ enhancer, 3’ regulatory regions 같은 cis-elements에 결합하는 지 여부를 ChIP(chromatin immunoprecipitation) 방법을 통하여 시험해 보았다. 그 결과 BZEL이 switch regions과 Eμ enhancer, 3’ regulatory regions에 결합한다는 것을 확인하였다. 또한, BZEL 단백질의 sumoylation 상태는 이러한 염기 서열과의 결합 정도를 조절을 하는 것을 확인하였다. 더불어 여러 연구들에서 CSR 과정이 DSB 반응과 연계되어 있다는 것이 알려져 있기 때문에 나는 BZEL이 chromosomal break의 marker로 생각하는 phoaphorylated histone H2AX(γ-H2AX) foci와 BZEL 단백질 간의 co-localization과 DNA repair 과정의 구성요소인 53BP1 단백질간의 결합여부를 시험 해 보았다. 그 결과, CSR이 진행되고 있는 B 세포에서 BZEL이 γ-H2AX와 co-localization이 되고 53BP1과 결합하는 것을 확인하였다. 무엇보다도, BZEL 특이적인 shRNA을 과발현 시켜 BZEL을 knockdown시킨 CH12F3 B 세포주에서 IgA로의 class switch recombination의 정도가 감소된 것을 확인하였다. 그러므로 이러한 결과들은 BZEL 단백질이 switch region이나 Eμ enhancer, 3’ regulatory regions 같은 cis-elements 부분에 결합하고 53BP1 같은 DNA repair 구성 단백질들과의 결합을 함으로써 germinal center B 세포의 CSR 과정을 조절한다는 것을 보여준다.
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