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PTEN gene delivery to human stem cells for tissue regeneration

Title
PTEN gene delivery to human stem cells for tissue regeneration
Other Titles
조직재생을 위한 줄기세포로의 PTEN 유전자 전달
Authors
정미라
Issue Date
2012
Department/Major
대학원 생명·약학부약학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
이승진
Abstract
Genetic modification of stem cells can maintain their functionality and improve therapeutic efficacy in tissue engineering. There are several transcriptional factors that might prolong life span of stem cells. Phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10 (PTEN) gene transduction can prolong the life span and maintain the differentiation potential of MSCs. Exogenous plasmid PTEN was transduced to MSCs and investigated its sustaining cellular properties in a long-term culture. Gene delivery to stem cells has been impeded by low transfection efficiency of the inserted gene and poor retention at the target site. Herein, I describe the use of non-viral gene transfer by cell-permeable peptide (CPP) to increase the transfection efficiency. High transfection efficiency was obtained using a human-derived arginine-rich peptide denoted as Hph-1 (YARVRRRGPRR). The transfection efficiency in hASCs treated with pDNA/Hph-1 complex was approximately 5-fold higher than that in cells transfected using Lipofectamine. Early and late passages of hASCs (P6 and P12) were used to study the role of pPTEN in cellular properties and differentiation potential. Multiple passages significantly decreased the differentiation potentials: P12 cells had lower adipogenesis and osteogenesis than P6 cells. After pPTEN transduction into the P12 cells (12P-pPTEN), adipogenesis increased 1.7-fold and osteogenesis increased 2-fold, compared to nontransfected P12 cells. pPTEN-hASCs showed significantly lower cell numbers with the expression of β-Galactosidase compared to nontransfected hASCs in P12. To evaluate the in vivo osteoinductivity of PTEN, scaffolds seeded with P6, P12 or P12-pPTEN hASCs were implanted in calvarial critically sized bone defects in rats. Newly formed bone was assessed by means of micro-computer tomography (micro-CT) and histological staining (Masson’s trichrom, osteocalcin). Micro-CT analysis showed greater bone volume fraction in P12-pPTEN hASCs than those in nontransfected P12 hASCs. Histological staining results were similar to the micro-CT results. Bone formation in P12-pPTEN hASCs was higher than that in nontransduced P12 ASCs. Karyotype analysis showed no significant chromosomal abnormalities in pPTEN-hASCs. Flow cytometric analysis of surface antigens on pPTEN-hASCs had no immunological difference with that of nontranduced hASCs, which implied that pPTEN-hASCs maintained their characteristic surface antigens, with no significant chromosomal abnormalities. These results suggest that PTEN plays an important role in maintaining the differentiation potential of hASCs in vitro and in vivo. Therefore, transplantation of genetically modified stem cells might improve the efficacy of stem cell-based therapies.;중간엽 줄기세포는 자가 증식능과 여러 체세포로의 분화능을 가지는 세포로서 세포치료와 조직재생에 널리 사용되고 있다. 그러나 줄기세포를 체내에 이식하기 전 장기간 체외 배양으로 인해 세포는 증식 지연, 세포크기 증가, 분화능 감소, 염색체 이상 그리고 분자수준의 변화 등을 일으키면서 노화된다. 이러한 변화는 임상 치료결과에 영향을 줄 수 있기 때문에 줄기세포의 quality control 이 필요하다. PTEN 유전자를 도입 함으로서 줄기세포의 증식기간을 연장시키고 분화능을 유지시킬 수 있다. 줄기세포에 플라스미드 PTEN의 전달 효과를 확인하기 위해 본 연구는 줄기세포의 분화능, 세포 표면 마커, 염색체 이상, 유전자 도입세포의 체내 이식실험 등을 수행하였다. 줄기세포로의 유전자 전달은 낮은 도입효율과 목적부위에의 짧은 체류시간으로 인해 한계를 가진다. 본 연구는 비바이러스성 유전자 전달체인 CPP를 사용하여 유전자 도입효율을 증가시켰다. 인간 유래 펩타이드인 Hph-1 (YARVRRRGPRR)을 사용하여 고효율로 유전자를 세포에 도입하였다. Hph-1을 이용한 도입효율은 Lipofectamine을 사용했을 때 보다 5배 정도 높게 나타났다. PTEN 유전자를 도입하였을 때 줄기세포의 특성과 분화능에 미치는 영향을 확인하기 위해 초기(P6)와 후기(P12)의 지방유래 줄기세포를 사용하였다. 체외배양을 여러 번 거듭할수록 분화능은 현저히 감소하였는데 P12 세포가 P6 세포에 비해 골분화능과 지방으로의 분화능이 감소하였다. 플라스미드 PTEN 을 P12 세포에 도입했을 때 그렇지 않은 세포보다 지방으로의 분화능은 1.7배, 골분화능은 2배 높아짐을 확인하였다. 세포 노화의 마커인 β-Galactosidase 도 PTEN 유전자를 도입한 세포에서 현저히 낮게 발현되었다. In vivo 에서 PTEN 유전자의 골형성 유도능을 확인하기 위해 쥐의 두개골 결손부위에 P6, P12 그리고 PTEN 유전자를 도입한 P12 세포를 각각 스캐폴드와 함께 이식하였다. 마이크로-CT 분석결과 PTEN 유전자를 도입한 P12 세포를 이식한 군이 PTEN 유전자 도입하지 않은 P12 세포를 이식한 군에 비해서 골재생이 훨씬 잘 되었다. 조직염색 결과도 마이크로-CT결과와 마찬가지로 PTEN 유전자를 도입한 군에서 골형성이 잘 되었음을 확인하였다. PTEN 유전자를 도입하기 전과 후 세포표면의 항원변화는 없었고 염색체 이상도 발견되지 않았다. 이러한 결과들은 줄기세포의 세포특성과 분화능 유지에 PTEN 이 중요한 역할은 한다는 것을 제시한다. 그러므로 PTEN 유전자를 도입한 줄기세포는 세포치료의 치료효율을 개선할 것으로 생각된다.
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Ph.D
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