Identification of a novel apoptosis inhibitory gene, RANI that encodes HECT domain-containing E3 ubiquitin ligase

Abstract

A novel apoptosis-inhibitory gene, RANI (resistance to apoptosis induction), was characterized by bioinformatical approach and biochemical functional analysis. RANI was identified by a series of gene cloning process using cDNAs whose expression confer resistance to p53-induced apoptosis. The full-length of RANI contains 823 amino acids, its molecular weight was approximately 94 kDa. Sequence similarity search showed that RANI encodes E3 ubiquitin ligase containing HECT domain spanning 343 amino acids (481-823) on its C-terminal half and found from HECT domain family proteins such as E6-AP, NEDD4, SMURF2, PUB1 and RSP5 which are true positive members based on pattern and motif searches. In comparison of amino acid sequences, the HECT domain from E3 ubiquitin ligase with that of RANI showed significant homology with 48% to 55%. RANI expression confers resistant phenotype to p53-induced apoptosis as well as other conditions inducing apoptosis, such as treatment with staurosporin and TNF-α, implicating that RANI blocks a common pathway of apoptosis. RANI protein was ubiquitylated in E2-dependent manner in vitro, and existed in ubiquitylated form and degraded by ubiquitin-proteasome pathway in vivo. RANI expression did not affect to cytoplasmic release of cytochrome c and subsequent cleavage of caspase-9, but caused absence of active form of caspase-3. Further analysis revealed that RANI did not lead to ubiquitination and degradation of active form of caspase-3 in vitro ubiquitination and also did not interact with procaspase-3 and active caspase-3 in GST-RANI pull down assay. These results suggested that RANl inhibits apoptosis through indirectly modulating cleavage of procaspase-3 and degradation of active caspase-3 via other proteins related apoptosis pathway. In yeast two-hybrid assay to screen target protein of RANI, several positive genes binding to RANl-HECT were selected such as HtrA-like serine protease (HtrA-2), dishevelled 1 (Dvl-1), metaxin 2 (MTX2) and proteasome subunit beta type. These proteins are highly related to apoptosis signal pathway and ubiquitin-proteasome protien degradation pathway. Especially, HtrA-2 and Dvl-1 contains PDZ domains which are protein-protein interaction recognition modules that play a critical role in organizing diverse cell signaling complexes, and on which RANI-HECT interacts with HtrA-2 and Dvl-1. In this context, RANI is implicated to inhibit apoptosis by regulating these proteins. The interaction mechanism between RANI protein and these reliable proteins would provide an invaluable clue in the completion of anti-apoptosis signaling transductions involved in RANI. Furthermore, comprehensive identification of anti-apoptotic signaling pathway regulated by RANI will extend to develop drugs against cancer and neuronal diseases.;본 연구에서는, 세포사멸 저항성 신 유전자 RANI (resistance to apoptosis induction)의 특성을 생물정보학적 접근법과 생화학적 기능분석법을 통해 규명하였다. 유전자 클로닝 방법을 이용하여, 대표적인 종양세포 억제 물질인 p53이 유도한 세포사멸 (세포고사: apoptosis)에 저항성을 나타내는 클론으로부터 억제작용에 기여한 유전자 RANI를 분리하였다. 유전자 데이터베이스 검색기법을 통하여, RANI는 823개의 아미노산으로 구성된 약 94kDa의 분자량을 지니는 단백질로 밝혀졌다. 단백질 서열분석법으로, 패턴 및 모티프 검색에서 'true positive' 단백질 집단으로 분류된 E6-AP, NEDD4, SMURF2, PUB1 그리고 RSP5 와 유사하게, RANI 또한, 카르복실기 말단 부위 쪽에 치우쳐있는 343 아미노산으로 구성된 (481-823) HECT 도메인을 보유하고 있는 E3 ubiquitin ligase 단백질을 발현하는 유전자임이 규명되었다. HECT 도메인 패밀리 단백질들과의 RANI의 HECT 도메인 아미노산 서열분석 결과 48%에서 55%의 높은 유사성이 밝혀졌다. RANI의 세포사멸 저항성에 대한 연구고찰 결과, 전형적인 세포사멸 유도 물질인 TNF-α와 staurosporin 이 초래하는 세포사멸 유발 과정에서도 p53과 유사한 정도의 저항성 효과를 발휘하였다. 이러한 결과를 근거로 RANI 의 항 세포사멸 기전은 일반적인 경로를 경유하여 초래되는 것으로 추정 되었다. RANI 단백질은 in vitro 에서 E2의 매개를 통하여 ubiquitin 과 결합하고, ubiquitin 복합체로 존재하는 것이 확인되었으며, in vitro 실험으로 RANI가 ubiquitin-proteasome 경로를 경유하여 제거되는 것이 규명되었다. 세포 내에서의 RANI의 과 발현 시, 세포질 쪽으로의 cytochrome c의 방출과 이에 따른 활성화 caspase-9의 형성은 관찰되었으나, 활성화 caspase-3가 나타나지 않았다. RANI 의 caspase-3 에 대한 작용기전을 명확히 밝히기 위한 실험결과, RANI는 caspase-3를 in vitro에서 ubiquitination 및 분해시키지 못하였고, GST-RANI pull down 실험결과 불활성화 procaspase-3 그리고 활성화 caspase-3 모두와 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 근거로, RANI가 세포사멸에 관여하는 다른 종류의 단백질에 대한 작용경로를 경유하여, 간접적으로 활성화 caspase-3의 형성 및 분해를 최종적으로 조절하는 것으로 추정되었다. RANI의 표적 단백질을 추적하기 위한 yeast two-hybrid screen 법에서, 세포사멸 경로와 더불어 ubiquitin-proteasome 의존성 단백질 분해 경로와 밀접한 관련이 있는 단백질들인, HtrA-like serine protease (HtrA-2), dishevelled 1 (Dvl-1), metaxin 2 (MTX2) 그리고 proteasome subunit beta type 등이 분리되었다. 특히 HtrA-2와 Dvl-1는 단백질 상호작용에 필요한 인식단위이자, 다양한 세포신호 복합체의 체계화과정에 핵심적 역할을 하는 PDZ 도메인에서 RANI 와 결합하는 것으로 추정되었다. 이러한 정황은 RANI가 위와 같은 단백질들에 대한 조절 기작을 통하여 세포사멸 억제에 기여할 것이라는 가능성을 시사한다. 결론적으로, RANI와 RANI의 표적물질로 추정되는 단백질들 사이의 상호작용 기작에 대한 분석은, RANI 연관성 항 세포사멸 신호 전달 기전의 규명에 필수적인 단서를 제공할 것이며 다양한 자극들의 세포사멸 작용을 이해하기 위한 필수적인 사안이 될 것이다. 또한 RANl 연관성 세포사멸 저항성 신호기전에 대한 포괄적인 규명은 암과 뇌신경 질환 등 여러 중요한 질병들의 치료방안을 강구하기 위한 필수 사안이 될 것으로 기대된다.