황소개구리(rana catesbeiana shaw)의 vitellogenin 수용체 유전자 cloning 및 발현 양상에 대한 연구

Abstract

Vitellogenin receptors(VTGR) are very important to egg-laying species since they mediate transport of yolk precursors into the oocytes during oogenesis. In the studies the VTGR gene of bull frog, Rana catesbeiana, was isolated, cloned and characterized to identify the sequences fo the gene and to understand the pattern of gene expression during oogenesis. VTGR gene was characterized by cloning of PCR products obtained by RT-PCR, by confirming the base sequences inserted into vector and by rearranging the sequences in order. In order to find VTGR gene of Rana from numerous cDNA, primers were directly designed and manufactured to apply to PCR from common sequences of VTGR and VLDLR genes of several vertebrates. The base sequences of VTGR gene of Rana was confirmed to be 2714 bp by RT-PCR and cloning. The 2.6 kb ORF of Rana VTGR gene coding a deduced 868 amino acids showed 78%, 72% and 73% homology with the reported Xenopus VTGR, chicken VLDL/VTGR and human VLDLR, respectively. In addition three dimensional structure constructed by SWISS MODEL with the protein of 868 amino acids deduced from 2.6 kb ORF shows a structure similar to LDLR supergene family, which also strongly suggest that the noble gene isolated is VTGR gene of Rana. VTGR of Rana, which belongs to LDLR supergene family, was found to consist of 5 domains including ligand binding domain containing a cluster of 8 cysteine-rich repeats, EGF-precursor homology domain containing YWSD sequence, O-linked sugar domain, transmembrane domain and cytoplasmic domain containing NPVY(Asn-Pro-Val-Tyr) consensus sequence required for internalization of the receptors. VTGR gene of Rana, which has 78% homology with Xenopus VTGR gene, did not detect Xenopus VTGR gene by RT-PCR and northern blot hybridization. Also, the VTGR gene of Rana was detected to be expressed predominantly in the small oocytes and in the ovary when performed by RT-PCR and northern blot. The function of 2.7 kb DNA was confirmed with mammalian cell, NH-REPH and CS-REPH, transfected with a recombinant plasmid pREP-H containing Rana VTGR cDNA. Transient expression of VTGR cDNA of Rana was determined by ligand binding assay with FITC-labeled VTG to VTGR protein encoded by the cDNA in the mammalian cells. The results strongly suggest that this 2.7 kb sequence containing 2.6 kb ORF is VTGR gene of Rana. These results showed that the DNA of 3.5 kb containing of 2.7 kb were confirmed in the study, is the VTGR gene of Rana. ; Vitellogenin 수용체(VTGR)는 생식의 선결조건이 되는 난자형성과정에서 난모세포 내로 난황전구물질의 유입을 매개하므로 매우 중요하다. 본 논문에서는 VTGR 유전자가 난자형성과정 동안 어떤 양상으로 발현되고 조절되는지 확인해 보기 위해, 황소개구리(Rana catesbeiana Shaw)의 VTGR 유전자를 분리하여 서열을 밝히고 유전자의 발현 양상을 살펴보았다. 황소개구리의 난모세포에서 추출한 mRNA로부터 얻은 cDNA에서 황소개구리 VTGR 유전자를 찾기 위해, 여러 척추 동물의 VTGR 또는 VLDLR 유전자에서 공통적인 염기 서열 부위를 찾아 확인하고, PCR에서 사용할 primer들을 제작하였다. 황소개구리 VTGR의 유전자를 찾는 작업은 RT-PCR에 의해 얻어진 PCR 생성물들을 cloning한 다음, vector에 삽입된 염기 서열을 확인하고, 이 서열들을 배열하여 연결하는 과정으로 수행하였다. 그 결과 황소개구리의 VTGR로 추정되는 2714 bp의 염기 서열을 찾았다. 2.6 kb의 ORF를 가지는 황소개구리의 VTGR 유전자는 여러 척추 동물들의 VTGR 또는 VLDLR 유전자와 비교해 보았을 때 비교적 높은 보존성을 가지는 염기 서열을 포함하고 있어, Xenopus와는 78%, 닭과는 72% 그리고 사람과는 73%의 아미노산 동질성을 나타내었다. 2.6 kb의 ORF로 추론된 868개의 황소개구리 VTGR의 아미노산 서열은 SWISS MODEL search에 의해 얻어진 3차원 구조에서 LDLR supergene family와 유사한 구조를 가지고 있음을 보여주어, 이 유전자가 황소개구리의 VTGR 유전자임을 강력히 시사해 주었다. 황소개구리의 VTGR 유전자는 LDLR supergene family에 속하였으며, cysteine이 많은 8개의 반복체인 ligand binding domain, YWSD의 서열을 포함하는 EGF-precursor homology domain, O-linked sugar domain, transmembrane domain 그리고 수용체를 내재화하는데 필수적인 NPVY(Asn-Pro-Val-Tyr) 서열을 갖는 cytoplamic domain으로 구성되어 있었다. 황소개구리의 VTGR 유전자는 Xenopus의 VTGR 유전자와 78%의 아미노산 동질성을 가지고 있으나, RT-PCR과 northern blot에서 Xenopus의 VTGR 유전자는 황소개구리의 VTGR 유전자에 의해 탐지되지 않았다. 또한 황소개구리의 VTGR 유전자는 northern blot 과 RT-PCR 결과에서 난자형성과정 중 난황형성전단계인 작은 난모세포에서 우세하게 발현하였으며, 여러 조직 중 난소에서 우세하게 발현하는 것으로 나타났다. 이번에 새롭게 밝힌 2.7 kb의 유전자가 황소개구리의 VTGR로서 기능을 하는지 확인하기 위해, 재조합 plasmid인 pREP-H를 만든 후, 이 DNA로 VTGR 유전자가 발현되지 않는 포유류 세포주인 NIH3T3와 COS-7 세포를 형질전환하였다. 형질전환된 포유류 세포인 NH-REPH와 CS-REPH세포들에서 분리한 RNA로 RT-PCR을 실시한 결과, pREP-H 유전자가 유전자 수준에서 발현되었음이 확인되었다. 또한 형질전환된 세포는 FITC로 표지된 황소개구리의 VTG와 결합시켜 ligand binding assay를 실시한 결과, NH-REPH와 CS-REPH의 세포막은 VTG와 결합함이 확인되어 형질전환된 세포의 세포막에 VTGR 단백질이 발현되었음을 보여주었다. 이러한 결과들은 이번에 새로 밝힌 2.7 kb의 염기 서열이 2.6 kb의 ORF를 포함하는 3.5 kb 크기의 황소개구리 VTGR 유전자이며, 이 황소개구리의 VTGR 유전자는 종 특이적이고 조직 특이적으로 발현되고 난자형성과정 중 단계 특이적으로 발현됨을 제시해 주었다.