The role of TGF β1 on epithelial-mesenchymal like transition in cancer cells

Abstract

TGFβ1은 multifunctional cytokine으로서 발생 과정과 상처 치유, 면역 반응, 암세포의 침윤 과정 등에서 여러 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 자궁경부암에서 유래한 SiHa 세포주를 사용하여 epithelial-mesenchymal 전환의 측면에서 TGFβ1의 영향을 조사하였다. 3차원 배양에서 TGFβ1을 농도별로 (0.1, 1, 10 ng/ml) 처리하였을 경우, SiHa 세포가 type I collagen gel matrix 안으로 농도 의존적으로 침윤되는 것이 관찰되었다. 2차원 배양에서도 3차원 배양에서와 같이 TGFβ1을 처리한 세포의 모양이 평평한 섬유아세포의 형태로 변화되는 것을 볼 수 있었다. TGFβ1은 세포간 물질의 발현에도 영향을 미치는 것으로 보여졌는데, fibronectin (FN)과 type I collagen (Col I)의 발현은 증가시켰고, laminin (LN)과 vitronectin (VN)의 발현은 별다른 영향을 받지 않았다. FN의 matrix assembly 또한 TGFβ1에 의해 유도되어 졌다. α1, α6와 αv등의 integrin은 TGFβ1 처리로 세포 표면의 발현이 증가된 반면, FN 수용체인 α5β1은 세포간의 접촉 부위에서 세포와 기질간의 부착 부위로 재배열되는 것을 관찰할 수 있었다. Actin의 발현 정도는 TGFβ1의 처리와는 무관하게 보여졌으나, 그 분포는 변화되는 것으로 보였다. Phalloidin을 사용하여 actin filament를 염색한 결과, 세포간의 경계면에 존재하던 actin이 TGFβ1에 의해 stress fiber projection의 형태로 위치가 변화되는 것을 확인하였다. Focal adhesion을 구성하는 vinculin과 talin이 focal contact 부위로 재배열되는 것이 관찰되었으며, focal adhesion kinase (FAK)의 인산화 또한 증가되었다. 이러한 세포의 모양 변화가 epithelial-mesenchymal 전환과 관련이 있는지를 알아보기 위해 섬유아세포의 표지로 알려진 vimentin의 발현 유무를 조사하였으나, 발현되지 않는 것으로 확인되었다. 그러나, E-cadherin을 조사한 결과, epithelial-mesenchymal 전환 과정에서와 마찬가지로 TGFβ1 처리로 인해 발현이 감소되는 것으로 관찰되었다. TGFβ1에 의한 epithelial-mesenchymal 전환의 유도는 TGFβ1를 제거한 후에도 actin 재배열과 FN matrix 형성이 보여지기 때문에 비가역적인 현상으로 사료되며, 이는 3차원 배양에서 TGFβ1를 제거한 후 침윤현상이 지속되는 것으로도 뒷받침되었다. SiHa 세포의 epithelial-mesenchymal 전환 과정을 시간별로 관찰해 보면, actin 재배열은 6시간 처리에서부터 보여지지만 FN matrix 형성은 16시간 처리에서 관찰되므로 actin의 재배열이 FN matrix의 형성보다 선행하는 것으로 사료되었다. Actin의 재배열과 FN matrix의 형성이 상호 의존적으로 발생하는지의 여부도 조사 되였다. Actin filament의 형성을 저해하는 물질인 cytochalasin D의 전처리로 actin filament가 완전히 붕괴된 상태에서도 FN matrix가 TGFβ1에 의해 유도되었으며 recombinant human FN을 배양액에 첨가하였을 때에도 actin filament의 재배열은 일어나지 않았기 때문에 두 가지의 사건이 독립적으로 일어날 수 있다는 가능성을 제시하였다. 또한, recombinant human FN을 3차원 배양에서 배양액에 첨가하였을 경우, SiHa 세포의 침윤을 유도하는 것으로 관찰되었다. 정상 상태의 구강 점막 (OM) 세포와 형질 전환된 표피세포인 HaCat, 그리고 편평 상피암 세포주인 SCC13 등도 조사하였는데 SiHa 세포에서 관찰된 형태의 변화는 유도되지 않았다. Actin filament의 재배열과 integrin의 발현 위치 변화, FN matrix의 형성과 E-cadherin 발현 감소 등으로 대표되는 이러한 결과들은 TGFβ1에 의한 SiHa 세포의 모양 변화가 배 발생 단계에서 관찰되는 epithelial-mesenchymal 전환과 유사하다는 사실을 뒷받침한다. TGFβ1의 이러한 영향은 SiHa 세포에서 침윤 현상을 유도하는데 관여할 것으로 사료된다. ; TGF 1 is a multifunctional growth factor implicated in various physiological processes during development, wound repair, inflammation, immune system function and tumor invasion. In this study, we have investigated whether TGF 1 stimulates epithelial-mesenchymal transition (EMT) in SiHa cell line, derived from human cervical squamous carcinoma, which may positively affect invasive transition of tumors. In the raft culture, SiHa cells did not invade into type I collagen gel matrix but TGF 1 supplement (0.1, 1, 10ng/ml) stimulated the invasion in a dose-dependent manner. In submerged culture as well as raft culture, TGF 1-treated cells showed distinct morphological change, flattened fibroblastic type. TGF 1 stimulated expression of fibronectin (FN) and type I collagen (Col I) but not of other extracellular matrix (ECM) components, such as laminin (LN) and vitronectin (VN). Matrix assembly of FN was also observed in the TGF 1-treated SiHa cells. Cell surface expressions of integrin 1, 6 and v were increased based on surface biotinylation and immunoprecipitation analysis while FN receptor ( 5 1) was exclusively relocalized from cell-cell contact sites to cell-substratum attachment sites. Although SiHa cells showed similar levels of actin with or without TGF 1 treatment based on immunoblotting analysis, its spatial distribution within the cells was dramatically changed. Phalloidin staining showed that TGF 1 stimulated reorganization of actin filament from apical ring like structure to stress fiber projection. Vinculin and talin were relocated to focal contacts by TGF 1. Phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) was also increased upon TGF 1 treatment. To investigate whether these fibroblastic morphological changes are related to EMT, we examined the expression of vimentin which is a major intermediate filament of fibroblasts. Although vimentin was not detected at all, E-cadherin, one of the molecules that is down-regulated during EMT, was decreased. These effects of TGF 1 on epithelial-mesenchymal (EM) like transition appeared irreversible, since removal of TGF 1 after 5 min treatment did not stop the actin rearrangement and the FN matrix assembly. It was also confirmed in SiHa cell raft culture because invasion was induced by the transient exposure of TGF 1. In the time course of EM like change by TGF 1 treatment in SiHa cell line, actin rearrangement begin to appear at 6hr when FN matrix assembly has not been started yet. Therefore, actin rearrangement seems to precede FN matrix assembly. Furthermore, we investigated whether these two events are dependent each other or not. SiHa cells were pretreated with cytochalasin D before the addition of TGF 1. Cytochalasin D-treatment did not disrupt TGF 1-induced FN matrix assembly, even though actin filaments were completely disrupted at this condition. In the same context, supplementation of soluble recombinant human FN to the culture media did not cause rearrangement of actin filaments in submerged culture, and it was enough to induce invasiveness in raft culture. We also investigated other epithelial cells, normal oral mucosal (OM), HaCat and SCC13 cells, but could not observe the morphological changes as shown in SiHa cells. In conclusion, TGF 1-induced fibroblastic morphological change of SiHa cell line, which were confirmed by the relocalization of actin and integrins, the assembly of FN matrix and the down regulation of E-cadherin, is similar to EMT observed in the embryonic development. These effects of TGF 1 may play a positive role in invasive transition of SiHa cell line.