사람 제대혈 CD34+ 세포의 thrombopoietin을 사용한 체외증폭에서 apoptosis와 거핵구 분화에 관한 연구

Abstract

본 연구에서는 사람 제대혈로부터 분리한 CD34+ 세포들을 thrombopoietin (TPO)을 조혈성장인자로 사용하여 혈청이 없는 조건에서 증폭하였다. 유세포분석기를 이용하여 체외에서 증폭된 세포들에서의 apoptosis의 측정과 면역표현형 분석을 동시에 시행하였을 때 CD44 발현의 감소로 구분되는 TPO에 의한 apoptosis 소견을 보이는 세포들은 CD61+ 분획에서 확인되었다. CD44의 발현정도에 따라 유세포분석기로 순수 분리한 세포 분획의 면역세포화학 분석에서는 CD44lo 분획이 apoptosis소견을 나타내면서 CD61을 발현하고 있는 반면, CD44hi 분획은 apoptotic한 소견을 보이지 않고 CD61을 발현하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 조혈전구세포배양에서는 배양 첫 9일 동안 총 거핵구 집락 수가 7.4±0.50배 증가하였다. 그 후로 거핵구 집락의 수는 apoptosis의 출현과 더불어 감소하였다. 거핵구 집락을 크기에 따라 분류하였을 때 거핵구 대집락의 비율은 시간이 경과함에 따라 점차 감소하는 반면 거핵구 중집락과 소집락의 수는 증가하였다. 특히, 배양 6일째부터는 거핵구 소집락이 거의 대부분의 집락을 이루고 있었다. 이상의 결과들은 제대혈 CD34+ 세포의 TPO를 사용한 체외증폭과정에서 거핵구계열 전구세포들이 증폭될 뿐만 아니라 성숙과정을 거쳐서 apoptosis로 진행하는 것을 시사해 준다. ; CD34+ cells, purified from human cord blood, were expanded in serum-free conditions with thrombopoietin (TPO). Multidimensional flow cytometry employing simultaneous measurement of apoptosis and immunophenotyping showed that the TPO-induced apoptotic cells, in which CD44 was downregulated, appeared in the CD61+ fractions. Immunocytochemical analysis of the FACS-sorted fractions revealed that the CD44-downregulated fraction was apoptotic and expressed CD61, whereas the CD44hi fraction looked healthy and did not express CD61. Clonogenic assay revealed 7.4±0.50-fold increase of total colony forming unit-megakaryocytes (CFU-MKs) during the initial 9 days. Thereafter, the number of CFU-MKs decreased, which was parallel with the appearance of apoptosis. When the MK colonies were subdivided according to size, the proportions of large colonies were progressively decreased as time lapsed, while those of medium and small colonies were increased. In particular from the 6th day, the small colonies became predominant. These results suggest that the megakaryocytic progenitors went on maturation as well as they were expanded during ex vivo expansion with TPO, and then proceed to apoptosis.