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Identification of Drosophila melanogaster Parkin as an E3 Ubiquitin-protein Ligase

Title
Identification of Drosophila melanogaster Parkin as an E3 Ubiquitin-protein Ligase
Other Titles
초파리 Parkin의 E3 ubiquitin-protein ligase로서의 특성규명
Authors
裵英珠
Issue Date
2004
Department/Major
대학원 생명과학과
Keywords
ARJPDrosophila melanogasterparkinParkinson’s diseaseubiquitin-protein ligaseApoptosisE3 ubiquitin-protein ligasep53PeanutSeptin1UbcH8
Publisher
梨花女子大學校 大學院
Degree
Doctor
Advisors
姜順子
Abstract
The genomic structure and expression of the Drosophila melanogaster homolog of human parkin were analyzed in this study. The 2,122 bp parkin sequence contains six exons that form a 1,449 bp transcript encoding a protein of 482 amino acids. 151 bp of 5? and 112 bp of 3? untranslated regions (UTRs) were identified by a combination of 5?-RACE/primer extension and 3?-RACE, respectively. The 5' UTR contains three transcription initiation sites. Neither a classical TATA nor a CAAT box was found in the putative promoter sequence. However, binding sites for AhR-Arnt, AP4, NF1 and GATA transcription factors were identified. Transient transfection analysis of the 5' UTR confirmed its promoter activity in HEK 293 cells and SH-SY5Y neuronal cells using a dual luciferase reporting system. The amino acid sequence of D. melanogaster Parkin exhibits 42%, 43% and 43% identity to that of human, mouse and rat, respectively, representing a 54 kDa protein band via Western blot analysis. It shows a high degree of conservation in the Ubiquitin-like domain at the N-terminus (34%), the In-Between RING (IBR) domain (65-69%), and the RING domains at the C-terminus (56-57%). The expression pattern of D. melanogaster parkin varies during the developmental stages, with the highest expression in the adult stage as measured by competitive RT-PCR. From immunostainings of the embryo, D. melanogaster parkin was expressed slightly higher in the central nervous system (brain and nerve cord) during the late embryonic stage. Key words : ARJP, Drosophila melanogaster, parkin, Parkinson?s disease, ubiquitin-protein ligase.; 본 논문에서는, 유전성의 약년성 파킨슨씨병(ARJP)의 주요 원인 유전자인 parkin의 특성 규명을 통하여 그 발병기전을 추적하고자, 초파리 parkin을 모델로 하여 연구하였다. 염기서열을 분석하여 초파리 parkin의 genomic DNA (2,122 bp)와 cDNA (1,449 bp)를 PCR을 이용하여 클로닝 한 후 genomic organization을 확인하였다. 5'/3' RACE, primer extension, luciferase assay를 이용하여, 6개의 exon, 5개의 intron, 5'/3' untranslated region, 전사 관련인자 등을 확인할 수 있었다. Western blot analysis 결과, Parkin은 482개의 아미노산으로 구성된 약 54 kDa의 분자량을 가지는 단백질로, 도메인 분석 결과 아미노기 말단의 Ubl 도메인과 카르복실기 말단의 RING1-IBR-RING2 도메인을 보유하는 E3 ubiquitin-protein ligase로 발현되는 유전자임이 밝혀졌다. 또한, 사람 Parkin의 염기서열과 비교해본 결과, Ubl 도메인에서는 34%, RING1 or 2 도메인에서는 56-57% 그리고 IBR 도메인에서는 69%의 높은 유사성을 보였다. 초파리의 발달단계에 따른 parkin의 발현 양상을 분석한 결과, late embryonic 단계로 갈수록 중추신경계의 발달과 더불어 parkin이 집중적으로 발현됨을 확인할 수 있었고, adult, embryo, larve, pupa 순으로 유전자의 발현이 왕성함을 알 수 있었다. 이러한 초파리 parkin의 구조와 발현에 대한 연구를 바탕으로, ubiquitin-proteasome pathway에서의 초파리 Parkin의 E3 ligase로서의 역할을 규명하였다. 특히 다양한 초파리 Parkin의 돌연변이체를 이용하여, E2 enzyme인 UbcH7 또는 UbcH8과의 in vivo binding assay를 한 결과 UbcH8과 특이하게 강한 상호작용을 보였으며, 이는 E3 ligase로서의 가능성을 나타내었다. 또한, in vitro ubiquitination assay를 통해 E2에 의존적인 ubiquitination 활성을 보임으로써, 초파리 Parkin은 in vitro에서 E2의 매개를 통하여 ubiquitin과 결합하고 ubiquitin 복합체로 존재하는 것이 확인되었다. 또한 in vivo 실험으로, 초파리 Parkin이 ubiquitin-proteasome pathway를 경유하여 제거되는 것이 규명되었다. Ubiquitin-proteasome pathway에서 초파리 Parkin의 substrate 단백질과의 상호작용을 분석하기 위하여, 사람 Parkin의 기능 확인이 안된 substrate 단백질들 중에서 septin 계열의 CDCrel-1과 CDCrel-2을 선택하였고, 이들과 높은 유사성을 보이는 초파리의 Pnut과 Sep1에 초점을 두어 연구하였다. 이들은 모두 초파리 Parkin과 binding하며 in vivo에서 Parkin의 존재 하에 ubiquitination되는 것으로 보아, Parkin의 substrate 단백질로의 가능성을 확인할 수 있었다. 최근의 연구에서, septin 계열의 단백질들이 퇴행성 뇌 질환이나 정신분열증 등의 질병과 관련되어 뉴런 간의 도파민 전달과정에 영향을 미친다는 보고가 있다. 이에 따라, 초파리 Pnut과 Sep1이 시냅스에서 vesicular 과정에 참여함을 보기 위하여 막 단백질인 Syntaxin과의 in vivo binding assay를 하였다. 그 결과, 두 단백질 모두 Syntaxin과 interaction함을 알 수 있었고 이는 exocytosis의 조절에 관여함을 시사한다. 즉, Ubiquitin-proteasome 의존성 분해 경로로 가지 못하고 세포 내에 septin 계열의 단백질인 Pnut, Sep1 또는 CDCrel이 이상 축적하게 되면, 도파민의 exocytosis가 저해되어 세포사멸(apoptosis) 경로로 진행되게 되는 것이다. 이러한 도파민 유도성의 세포사멸에서 Pnut와 Sep1의 작용을 확인한 결과, 도파민이 p53에 의존적인 세포사멸을 유발하고 Pnut과 Sep1이 그 사멸 속도를 증가시킴을 볼 수 있었다. 이는 Pnut과 Sep1이 도파민의 exocytosis 저해와 더불어, 세포사멸 경로에서 직접적인 상호작용을 하는 것으로 추정되며, 이의 확인을 위하여 caspase 저해단백질인 XIAP와의 in vivo binding assay를 하였다. 그 결과, Pnut과 Sep1 모두 XIAP와 강하게 상호작용하였으며, 이는 downstream의 caspase 활성화에 기여할 가능성을 시사한다고 볼 수 있다. 결론적으로 이 모든 과정을 통하여 septin 계열의 초파리 Pnut과 Sep1뿐만 아니라, 사람의 CDCrel 단백질도 Parkin과의 상호작용으로 p53 의존성 세포사멸에 영향을 줄 것으로 기대된다. 이는 파킨슨씨병의 의학적 원인인 신경세포의 손실로 인한 도파민 부족의 유발기전 규명과 이해에 필수적 단서를 제공할 수 있다. 또한 이러한 질병 관련 세포사멸 경로를 차단함으로써, 치료방안 개발의 가능성을 제시할 수 있으리라 기대된다. Key words : Apoptosis, ARJP, Drosophila melanogaster; E3 ubiquitin-protein ligase, p53, Parkin, Parkinson?s disease, Peanut, Septin1, UbcH8.
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Ph.D
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