Time-resolved energy transfer studies on biomolecular interactions

Abstract

Energy transfer in the spectroscopy is an interesting phenomenon that provides us a plenty of information on biomolecular structure and dynamics. We especially focused on the biomolecular interactions such as heme proteins and beta-amyloid (Aβ) peptides using homo transfer of pyrenes and fluorescence resonance energy transfer (FRET). FRET involves spectrally distinct donor and acceptor (hetero-FRET) or a single type of fluorophore (homo-FRET) detected respectively by the fluorescence lifetime measurement and the fluorescence anisotropy through time-correlated single photon counting (TCSPC) system. We firstly focused on the detection for the early stage of Aβ aggregation and screening of its small molecular inhibitors through pyrene fluorescence analysis. Pyrene-labeled Aβ11-25 (Py-Aβ) can be utilized to quantify the monomer-dimer equilibrium depending on the environments owing to the unique spectral features of pyrene. We developed the steady-state fluorescence assay system that is able to simultaneously monitor the time-dependent intensity of both monomer peak and excimer bands. We measured the aggregation inhibition efficiency of the drug candidates according to the excimer/monomer ratio, calculated by comparing the emission intensity of monomer peak with respect to the excimer band. Our assay explored a set of objectively chosen candidates that exhibit the high degree of anti-aggregation, which requires a molecular level understanding of small molecule-amyloid interactions. Also, we first present the experimental results on the excluded volume effect by employing time-resolved hetero-FRET. Coumarin 334 (C334) was used as the energy donor whereas hemin and cytochrome c (cyt c) were used as the energy acceptors. Fluorescence resonance energy transfer from a donor to multiple acceptors is an interesting subject. Numerous studies using theoretical models and simulations have focused on the excluded volume effect, which was not considered in Förster’s first derivation. The fluorescence intensity decays were measured for C334 surrounded by a number of acceptors in polyacrylic acid. We have observed that the excluded volume effect is markedly pronounced with cyt c compared with hemin, when the acceptor concentration is high (>5 mM). The results, which may be explicitly described by the relative molecular sizes of two acceptors, showed that the excluded volume effect should be considered in the interpretation of FRET data, especially when bulk chromophores are used. In addition, we investigated the conformation of Aβ that causes Alzheimer’s disease (AD) by its toxic aggregates which result from the accumulation of misfolded β-amyloid (Aβ) peptide using hetero-FRET combined with fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). It has been reported that oligomeric Aβ1-42 easily internalizes the intracellular space by an endocytic process and is transported to the lysosome whereas fibrillar Aβ1-42 cannot enter. We investigated the cellular uptake of Aβ11-25 dependent on its conformation, in which the key aggregation motif, KLVFF (16-20) exists. The conformational structure of Aβ is very sensitive to environmental conditions, and thus it can be detected by FLIM-based FRET. Rather than giving only visualization of the object, the technique provides information on vicinity between donor and acceptor. We designed a FRET Aβ probe in which coumarin 343 as a donor and DABMI as an acceptor were attached to the ends of Aβ11-25. The same tendency of selective cellular uptake as full-length Aβ sequence was drawn based on FLIM-FRET analysis. ;분광학에서 에너지 전달은 특히 생분자 구조와 동력학적인 정보를 제공해 준다는 점에서 흥미로운 현상이다. 본 연구에서는 pyrene 간의 에너지 전달과 형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)을 이용하여 heme 단백질과 베타 아밀로이드 펩타이드 (Aβ)와 같은 생분자의 상호작용 연구에 초점을 맞추었다. FRET은 분광학적으로 다른 특성을 가진 에너지 주개와 에너지 받개 간의 에너지 전달 현상인 동형 형광 공명 에너지 전달 (hetro-FRET)과 한 종류의 형광단에서 일어나는 이형 형광 공명 에너지 전달 (homo-FRET)으로 나뉜다. 각각은 시간 상관 단일 광자 계수법 (TCSPC)를 이용하여 형광 수명 시간과 형광 비등방성을 통해 측정 가능하다. 첫째로, 본 연구는 pyrene 형광 분석법을 이용한 Aβ 응집의 초기 단계를 검출하고 이 응집을 저해할 작은 분자를 스크리닝하고자 하였다. 특유의 분광학적 특성을 가진 pyrene이 라벨링된 Aβ11-25 (Py-Aβ)는 주변 환경에 의존하는 단량체-이량체 평형을 정량화하는 데 활용될 수 있다. 본 연구실은 pyrene의 단량체와 들뜬 상태에서 존재하는 이량체가 갖는 형광 세기를 실시간으로 모니터링 할 수 있는 정상적인 형광 어세이 시스템 (steady-state fluorescence assay system)을 구축하였다. 이 시스템을 통하여 얻은 형광세기에 비례하는 엑시머/단량체 비에 따라 알츠하이머 병을 예방 할 수 있는 후보물질의 Aβ 응집 저해 효율을 계산하였다. 본 어세이 연구는 작은 분자와 아밀로이드 간의 상호작용을 분자수준에서의 이해하여 선정된 5가지 항 응집 물질을 이용하여 진행되었고, 이미 알려진 curcumin과 hemin 외에 아조벤젠 유도체인 disperse red 1, disperse orange 3도 아밀로이드 응집 저해제로서의 가능성이 보임을 밝혔다. 둘째로, 본 연구를 통해 시분해 동형 형광 공명 에너지 전달 (time-resolved hetero-FRET)을 이용하여 배제 부피 효과의 실험적인 결과를 처음으로 밝혀내었다. 단일 에너지 주개에서 다수의 에너지 받개로 에너지가 전달되는 형광 공명 에너지 전달 현상은 흥미로운 주제이다. 지금껏 Förster’s first derivation에서 고려되지 않은 배제 부피 효과에 관한 연구들은 이론 모델이나 시뮬레이션을 통해 이루어져왔으나 이에 대한 실험적 연구는 진행된 바가 없었다. 따라서 본 연구에서 coumarin 334 (C334)는 에너지 주개로, hemin과 cytochrome c (cyt c)는 에너지 주개로 사용하여polyacrylic acid (PAA)에 함입되어 있는 다수의 에너지 받개로 둘러싸인 C334의 형광 세기 감쇠를 측정하여 배제 부피 효과를 입증하고자 하였다. 에너지 주개의 농도가 높을 때 (>5 mM) hemin에 비해 cyt c에서 배제 부피 효과가 뚜렷하게 나타나는 것을 관찰 하였다. 이 결과는 두 에너지 주개의 상대적인 분자의 크기에 의해 설명할 수 있으며 벌크 발색단을 이용한 FRET 데이터를 해석할 때 배제부피 효과를 고려해야함을 시사한다. 마지막으로, 본 연구는hetro-FRET과 형광 수명시간 이미징 현미경법 (FLIM)을 결합하여 응집 시 신경세포에 독성을 갖고 뇌에 축적되어 알츠하이어병을 유발하는 Aβ의 형태를 연구하고자 하였다. 올리고머 형태의 Aβ1-42는 엔도시토시스에 의해 세포 내에 진입하여 리소좀에 축적되지만 피브릴 형태는 세포 내에 진입하지 못한다고 보고된 바 있다. 우리는 주요한 응집 모티프인 KLVFF (16-20)을 가운데에 포함한 Aβ11-25의 형태에 따른 세포 내 진입에 관해 FLIM 기반의 FRET을 이용하여 알아보고자 하였다. 이 실험 기술은 환경 조건에 매우 민감한 Aβ의 형태 구조를 분석하기에 적합한 방법이다. 또한, 시료의 형태를 영상화 해줄 뿐만 아니라, 에너지 주개와 에너지 받개 간의 거리에 관한 정보도 제공해준다. 우리는 coumarin 343와 DABMI가 각 에너지 주개와 받개로 아밀로이드 펩타이드 양 끝에 라벨링 된 FRET 아밀로이드 프로브를 디자인 하였다. 결론적으로FLIM-FRET 분석을 기반으로 Aβ의 형태에 따라 선택적으로 세포 내에 흡수 된다는 것을 밝혔다.