Haemophilus influenzae type b serum bactericidal assay

Abstract

The protective capacity of antibodies induced with Haemophilus influenzae type b (Hib) vaccines can be directly measured with a serum bactericidal assay (SBA) with anti-PRP antibody but it is very tedious to perform due to manual counting of bacterial colonies. To overcome this limitation we automated colony counting and investigated the effect of varying assay components on bactericidal titers. SBA was performed using a modified assay in which bacteria survived were enumerated after plating on BHI agar and overlay agar containing 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC). To determine intra-assay variability, sera were tested 5 times in one assay run. To determine short-term inter-assay variability, 11 independent assays with same lot of reagents were tested. To determine the effect of varying assay components, the assay was performed each with two different batches of bacterial stock and two different batches of complement. Study analysis showed that coefficient of variation (CV) of bactericidal index (BCI) obtained from all assays ranged from 1% to 38% which indicates that SBA is very stable enough to evaluate the effect of the Hib vaccine. We developed a rapid SBA for anti-PRP antibodies that requires little effort, reagents, and sera. Since CV is independent of reagents lots and operators, the assay may be performed in many laboratories.;Haemophilus influenzae type b (Hib) 예방 접종에 의하여 유도된 항체의 방어 능력은 혈청 살균능 검사 (Serum bactericidal assay, SBA)를 통한 항-PRP 항체가를 통해 직접적으로 측정할 수 있다. 그러나 이 방법은 직접 집락수를 일일히 세어야 하기 때문에 많은 시간과 노력이 요구되며, 이러한 제한점으로 인하여 혈청 세균 살상능 검사를 널리 표준화하여 시행하는데 한계가 있었다. 본 연구에서는 세균 집락수 측정 절차를 자동화한 방법으로 4군의 성인 혈청에서 세균, 보체의 종류 및 실험에 따라 실험 결과에 영향을 주는지 여부를 알아보았다. Hib Eagan strain의 Hib 균으로 변경된 방법의 SBA를 시행하여 BHI agar 에 plating 후 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC)가 포함된 overlay agar를 덮고 살아남은 세균의 수를 측정하였다. Intra-assay 재현성을 보기 위하여 같은 serum으로 5회씩 실험을 반복하였고, inter-assay 재현성을 보기 위하여 같은 시약과 혈청으로 11회의 실험을 하였다. 또한 각각 준비한2군의 세균과 보체를 이용하여 다양한assay 구성 요소에 의한 영향을 알아보았다. TTC를 첨부하면 자동화된 집락수 측정 프로그램을 통하여 집락수를 신속히 측정할 수 있다. Bactericidal index (BCI)의 변이 계수 (Coefficient of variation , CV)는 1 ~ 38% 의 범위를 보여 Hib ELISA의 CV의 허용 가능한 범위 내에 있었다. 따라서 본 연구에서는 적은 노력과 시약 및 혈청을 이용하여 신속하게 항-PRP 항체가를 측정할 수 있는 SBA 를 시도하였으며, CV 값이 시약이나 실험자에 대해 영향을 적게 받으므로 많은 실험실에서 본 assay를 시행할 수 있을 것이다. 따라서 S. pneumonia 의 anti-capsular 항체에 대한 multiplexed opsonophagocytic assay (MOPA) 와 유사하게 표준화된 SBA의 도입이 가능할 것이다.