Intracelluar antibody to pSTAT3(Y705) as a novel motif-specific inhibitor of signal transduction

Abstract

Signal transducers and activators of transcription (STATs) 단백질은 잠재적인 세포질내의 전사요소로서 세포막에서부터 핵 안으로 신호를 전달한다. STAT 구성원 중의 하나인 STAT3는 인터루킨-6 처리에 의한 급성반응요소로서 발견되었다. STAT3는 대부분의 암세포나 인간의 암에서 필수적으로 활성화된다. STAT3는 면역반응, 세포 내 변형, 생존, 암의 성장에 관련되어 있다. STAT3의 타이로신 705번 잔기의 인산화는 STAT3 단백질을 활성화시키고, 이합체화와 핵 안으로의 이동을 일으킨다. 핵 안으로 이동된 STAT3는 DNA에 붙어 하위 타겟 유전자들의 전사를 유도한다. 암의 형성에 중요한 요소인 STAT3는 암의 예방과 치료에 연구되어 왔다. 타이로신 705번째 잔기의 인산화로 인해 활성화된 STAT3 의 차단을 연구하기 위해서, phage display방법을 이용하여 타이로신 잔기 705번째가 인산화된 STAT3를 특이적으로 인지하는 항체를 만들었다. 선택된 항체는 타이로신 잔기 705번이 인산화되어 있는 STAT3부근에 특이적으로 높은 친화도로 인식할 수 있다. 우리는 또한 새로운 단백질의 특정부분에 대한 저해제로서, 세포내에서 타이로신 705 부분이 인산화된 STAT3를 인지할 수 있는 세포 내 항체를 만들었다 (세포 내 항체: Intrabody). HepG2 세포 내에서 만들어진 세포 내 항체는 인터루킨-6에 의해 활성화되는 STAT3가 핵 안으로 이동하는 것을 억제하고, 이미 STAT3의 발현 제거(knock down)를 통해 알려진haptoglobin, fibrinogen, SOCS3와 같은 STAT3의 하위 타겟 유전자의 발현을 억제시켰다. 그리고 HepG2 세포에서 인터루킨-6에 의해 발현이 억제되었던 cyclinA의 발현을 세포 내 항체의 발현으로 발현을 회복시켰다. 게다가, HepG2 세포 내에서 PMA에 의한 STAT3의 타이로신잔기 705번의 인산화가 발견되지 않고, 세린잔기 727번의 인산화가 우세하게 일어나는 상태에서 세포 내 항체는 세린잔기 727번 인산화에 의해 조절되는 유전자의 발현에 영향을 주지 않았다. 또한 세포 내 항체는 STAT3의 발현 제거(knock down)했을 때와 비교하여JNK의 활성화 정도의 차이를 보였다. STAT3의 발현을 억제하기 위해서, 발현제거(knock down), 화학적인 저해제들, 우세적으로 부정적으로 발현되는 단백질의 과다발현(dominant negative protein overexpression)이 수행되어왔다. 그러나 이러한 방법들은 다른 신호전달에 영향을 주지 않으면서 단백질의 특정부분만을 선택적으로 저해하지 못한다. 그러나 본 연구의 세포 내 항체는 다른 세포신호전달에 영향을 주지 않고 인산화된 부분만을 특이적으로 억제할 수 있다. 종합하여 보았을 때, 특정부분만을 억제하는 세포 내 항체는 세포 내에서 일어나는 단백질의 특정한 변형의 역할을 연구하는데 뛰어난 방법이 될 수 있다고 예상된다. ;Signal transducers and activators of transcription (STATs) are the latent cytoplasmic transcription factors which transmit signals from the cell membrane to the nucleus. One of the family members, STAT3 is discovered as an acute phase response factor by IL-6 stimulation. STAT3 is constitutively activated in most cancer cells and human tumors. This factor is associated with inflammation, cellular transformation, survival and proliferation of cancers. Phosphorylation of tyrosine 705 leads to STAT3 activation. Activated STAT3 is dimerized and nuclear translocated. Nuclear translocated STAT3 binds to DNA and transcribes the downstream target genes. STAT3 is the critical tumorigenic factor which has been investigated for the prevention and therapy of cancers. To inhibit the function of activated STAT3 which is tyrosine 705 phosphorylated, we generated an antibody which can recognize pSTAT3(Y705) specifically by phage display method. Selected antibody can specific recognize to the tyrosine 705 phosphorylated region of STAT3 with high affinity. We also developed the intracellular expressed antibody (intrabody) as a novel motif specific inhibitor which can recognize intracellular tyrosine 705 phosphorylated STAT3. In HepG2 cells, the intrabody blocked the nuclear translocation of IL-6 activated STAT3 and inhibited the expression of downstream target genes such as haptoglobin, fibrinogen and SOCS3 whose expression was previously reported to be down-regulated by knock down of STAT3. And IL-6 stimulated inhibition of cyclin A expression is recovered by intrabody expression in HepG2 cells. Furthermore, in PMA stimulated HepG2 cells which were dominantly phosphorylated the serine 727 region of STAT3 without detectable tyrosine 705 phosphorylation, intrabody did not affect the expression of genes regulated by STAT3 serine 727 phosphorylation in HepG2 cells. In addition, this reagent showed the different activation level of JNK compared with the STAT3 knock downed cells. To inhibit STAT3 activation, knock down of STAT3, chemical inhibitors and dominant negative protein overexpression were used. These methods could not inhibit specific sites of protein without affecting other signaling. In this study, the intrabody that we generated can specific inhibit pSTAT3(Y 705) signaling without affecting other signaling pathway. Taken together, it is speculated that site-specific inhibition of intrabody can be a distinguished reagent to analyze the specific function of site specific modification in cell signaling.