Role of a novel adaptor protein, ARAP in T cell activation

Abstract

T 임파구와 항원제시세포 (APC) 가 상호작용되는 세포막 연접부위인 Immunological synapse (IS) 는, 세포막의 detergent-insoluble 지역인membrane rafts 에서 주로 형성된다. IS 가 형성되면서 T 임파구 수용체 (TCR) 및 초기 신호전달에 관련되는 단백질들인 LAT, Lck 등이 membrane rafts 안으로 모여들고 이 부위 내에서 세포질에 존재하는 다양한 신호 전달 단백질들의 복합체를 형성하여 T 임파구의 활성화를 유도한다. 따라서, IS 의 형성 및 유지는 전반적인 T 임파구의 활성을 조절하는 중요 요인이라 할 수 있다. TCR 자극 후 타이로신 인산화 효소인 Lck 에 의해 TCR/CD3z chain 내의 ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) 이 인산화 되고, ZAP-70 타이로신 인산화 효소의 결합을 유도하여 활성화시킨다. 이렇게 활성화 된 타이로신 효소들은 LAT, SLP76 와 같은 adaptor 단백질들의 인산화를 유도하여 T 임파구의 활성화를 촉진한다. 즉, LAT 과 SLP76 의 결합을 통해 PLCγ1 이 세포막으로 이동하여 활성화되고 T 임파구 전사인자인 NF-AT 의 활성화를 유도하는 신호전달을 시작한다. 또한, Vav1, Nck 등과 같은 단백질과 signalosome 을 형성하여 actin polymerization 을 유도함으로써 세포 골격 변화를 조절하는 신호를 야기한다. 이 과정에서, TCR 의 활성화에 의해 integrin 수용체의 복합체 형성을 유도하여 IS 형성을 지속적으로 유지시키는 기작을 ‘inside-out 신호 전달’이라 한다. 본 논문에서는 membrane rafts 를 중심으로 시작되는 초기 TCR 신호전달 복합체를 분리하여 분석하고자 하였다. 특히, TCR 자극 후에 타이로신 인산화가 일어나는 단백질들을 중심으로 분석하여 T 임파구 신호전달에 관련되는 새로운 단백질들을 발견하고 신호전달 기전을 이해하고자 하였다. 전반부에서는 이러한 과정에 의해 동정된 신규 단백질의 기능을 연구하였다. Human Jurkat T 세포 주로부터 분리된 membrane rafts 내에 존재되는 단백질들 중 TCR 자극에 의해 타이로신 인산화가 일어난 단백질들을 인산화된 타이로신을 인지하는 특이 항체로 면역 침강하여 분리하였고 gel 상에서 분자량 별로 분리 한 후 질량 분석법을 도입하여 분석하였다. TCR 자극 후에 타이로신 인산화가 일어나고 membrane rafts 로 이동된 신규 단백질을 발견하였고 ARAP (Activation-dependent, Raft-recruited ADAP-like phosphoprotein) 이라 명명하였다. ARAP 은 proline-rich (PR), SH3 domain 및 인산화가 가능한 18 개의 tyrosine 잔기를 포함하며, 구조적으로 이미 알려진 adaptor 단백질인 ADAP (Adhesion and degranulation-promoting adaptor protein) 과 sequence 유사성이 있음이 확인되었다. ARAP gene 이 결여된 knock-out 마우스와 shRNA 에 의해 ARAP 의 발현이 억제된 Jurkat T 세포 주를 이용하여 ARAP 의 기능을 연구하였고, 그 결과, ARAP 단백질이 T 임파구의 분화에는 관여하지 않지만, TCR 자극에 의한 초기 신호전달과, 그에 따른 T 임파구의 활성화 및 증식에 관여함을 밝혔다. 특이하게도, ARAP 은 TCR 자극에 의한 inside-out 신호전달에 의한 integrin 활성화와 세포 결합능의 조절에 관여하는 반면, Rac1 의 활성화를 통한 actin polymerization 에는 관여하지 않음을 또한 밝혔다. ARAP 단백질이 결여됨으로써 나타나는 이러한 T 임파구의 기능저하는 ARAP 이 결여된 마우스에서 자가면역성 뇌척수염 (EAE) 을 유도하였을 때 발병율이 감소됨을 확인함으로써 증명하였다. 또한, ARAP 단백질의 domain 및 인산화가 일어나는 타이로신들을 분석하고 결합하는 단백질을 측정하는 과정에서 T 임파구 신호전달에 관여하는 기전은 타이로신 인산화를 통한 adaptor 단백질 SLP76 (SH2 domain-containing leukocyte phos-phorylation of 76 kDa) 의 결합에 기인함을 밝혔다. 따라서, ARAP 은 구조적으로 ADAP 과 유사하고 SLP76 와 결합하여 작용하는 점은 동일하지만, TCR 자극에 의한 actin polymerization 과 integrin 활성화를 유도하는 ADAP 과는 달리 초기 T 임파구 신호전달에 관여한다는 점에서 ADAP 과 구분되는 신규 adaptor 단백질이라 할 수 있다. 논문의 후반부에서는 TCR 자극 전과 후의 LAT-SLP76-PLCγ1 의 복합체를 연구하여 T 임파구의 초기 신호 전달 과정을 이해하고자 하였다. 이전의 연구 결과들에 의하면 T 임파구에서 PLCγ1 은 SLP76 adaptor 단백질과 결합되어 존재하고 있으며 이러한 PLCγ1-SLP76 결합이 T 임파구 활성화 기전에 필수적임이 알려졌다. 또한 두 단백질간의 결합은 PLCγ1 의 SH3 domain 과 SLP76 의 P1 region (SLP76 의 proline rich region 중 67 개의 아미노산 서열) 이 매개됨이 보고되었다. 본 논문에서는 SLP76 가 결여되었거나 또는 SLP76 의 P1 region 이 결여되었을 때 PLCγ1 과 결합하는 단백질 및 그에 따른 T 임파구 활성화 변화를 분석하였다. SLP76 가 결여된 J14 세포 주와 J14 세포 주에 P1 region 이 결손된 SLP76를 발현시킨 J14 세포 주, J14/SLP-P1 을 이용한 실험에서, PLCγ1 과 SLP76 의 결합이 일어나지 않는 조건에서 PLCγ1 은 LAT 과 결합하여 존재함을 밝혔다. 또한, 이렇게 LAT 과 PLCγ1 이 결합되어 있는 경우에는 TCR 자극을 주어도 T 임파구의 활성화에 따른 신호전달 단백질들의 membrane rafts 로의 이동 및 복합체 형성들이 일어나지 않음을 확인하였다. 더 나아가 LAT 단백질 내에 SLP-P1 과 유사한 sequence 가 존재됨을 밝혔고, PLCγ1 의 SH3 domain 과 LAT-P1-hom 을 통하여 두 단백질 간의 결합이 이루어짐을 확인하였다. 따라서, PLCγ1 은 SLP-P1 과 LAT-P1-hom 모두에 결합할 수 있고 SLP76 또는 SLP-P1 이 없는 경우에 LAT-P1-hom 과 결합함을 증명하기 위하여 PLCγ1-LAT 결합이 SLP-P1 또는 SLP76 존재 하에는 일어나지 않음을 competition assay 를 통하여 증명하였다. 이러한 결과들로부터 PLCγ1 은 SLP-P1 과 유사한 sequence 를 갖는 단백질과 결합할 수 있고 PLCγ1 과의 affinity 가 가장 높은 SLP-P1 과 결합하여 존재한다는 새로운 해석을 확립하였다. 또한, PLCγ1 이 TCR 자극 후에 타이로신 인산화를 통해 LAT 과 결합하여 membrane rafts 로 이동하여 활성화되기 위하여는 PLCγ1-SLP-P1 의 결합여부가 중요하다는 확립된 기전을 이해하는 근거를 제시하였다.;Engagement of T cell receptor (TCR) by specific antigen-major histocompatibility complex (MHC) complexes presented by antigen-presenting cells (APCs) is central to the effective induction of an antigen-specific T cell response. This cognate antigen presentation, taking place at the T cell-APC interface called the immunological synapse (IS), triggers biochemical signaling cascades involving multiple cellular proteins leading to T cell activation, proliferation, and differentiation. On TCR ligation, there is a sequential activation of the Src family kinase Lck, which in turn phosphorylates immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAM) present in the CD3/TCR complex. Phosphorylation of the ITAM allows for activation and recruitment of zeta-assiciated protein kinase of 70 kDa (ZAP-70). It phopshorylates the transmembrane adaptor protein linker of activated T cells (LAT) and the cytosolic protein SH2 domain-containing leukocyte phosphorylation of 76 kDa (SLP76). This allows for recruitment of SLP76 to LAT at membrane rafts that are specialized microdomains in the plasma membrane and the formation of a multimolecular complex composed of several other important proteins, including phospholipase gamma1 (PLCgamma1), Vav1, noncatalytic tyrosine kinase (NCK), and adhesion and degranulation–promoting adapter protein (ADAP). The formation of this complex is essential to propagate distal TCR signaling and successful T cell activation. The importance of these proximal events is evident as the genetic deletion of LAT or SLP76 prevents the formation of signaling complex at the membrane rafts and results in a lack of T cell responses to antigenic stimulation. To further study TCR-mediated T cell activation, 1) molecules recruited to the membrane rafts following TCR ligation were analyzed and 2) initial signaling complexes including LAT, PLCgamma1, and SLP76 were re-examined. To identify proteins that were recruited to membrane rafts and involved in the early TCR signaling after antigen stimulation, phosphotyrosine proteins were isolated by an immunoprecipitation of membrane rafts purified from Jurkat T cells either at a resting or an activated state using anti-phosphotyrosine antibodies. Further separation and identification of the proteins were performed by a liquid chromatography and tandem mass analyses. One molecule that was identified by this method showed sequence similarities to a well-known T cell adaptor protein, ADAP. Thus, the molecule was named as activation-dependent, raft-recruited ADAP-like phopshoprotein, ARAP. ARAP contains Src homology 3 (SH3) domain, multiple putative tyrosine phosphorylation motifs and proline rich (PR) domain. Functional studies of ARAP were performed in T lymphocytes isolated from ARAP-deficient mice and in ARAP-suppressed Jurkat T cells. Suppression of ARAP gene in Jurkat T cells showed impaired T cell activation via TCR, such as, phosphorylation of ERK and PLCgamma1, calcium increase, and NF-AT and integrin activation. T cells from ARAP-deficient mice developed normally, but showed impaired responses in up-regulation of activation markers CD69 and CD25, IL-2 secretion, and proliferation following TCR ligation. ARAP-deficient mice also showed less severe clinical course of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) following immunization of mice with the encephalitogenic peptide, myelin oligodendrocyte glycol-protein (MOG). Analyses of tyrosine mutants of ARAP showed that ARAP plays a role in T cell activation by the association with SH2 domain of SLP76 through tyrosine-phosphorylation of ARAP. These results suggest that a novel T cell adaptor protein, ARAP, may play important roles in TCR signaling. To characterize initial signaling complexes containing LAT, PLCgamma1, and SLP76 at resting or activated states, molecules associated with PLCgamma1 were examined in the absence of SLP76, more specifically, the SLP76 P1 domain, a 67-amino-acid functional domain within the proline-rich region of SLP76. Because activation of PLCgamma1 requires constitutive interaction of SLP76 with the SH3 domain of PLCgamma1 through the P1 domain, PLCgamma1 associated with LAT instead when the constitutive association with SLP76 was blocked. Further experiments demonstrated that LAT competed with SLP76 for PLCgamma1 binding and that LAT interaction with PLCgamma1 was mediated by the SH3 domain of PLCgamma1. These results provide a possible mechanism for the constitutive association between SLP76 and PLCgamma1: the SLP76-PLCgamma1 association in resting T cells is required to prevent an association between LAT and PLCgamma1 that leads to the premature recruit-ment of PLCgamma1 to membrane rafts.