Protective Roles of Antioxidant Proteins against Oxidative Stress in the Kidney

Abstract

Thioredoxin1과 20% 아미노산 배열상의 유사성을 가진 Thioredoxin-related protein 14 (TRP14)는 WCGPC motif에 2개의 활성화 사이트 Cysteine 잔기를 가진 새로운 14kDa disulfide reductase이다. TRP14 활성화 사이트의 cysteine은 nucleophilic하지만 산화 환원 능력은 Trx1과 유사하며, Trx1처럼 Thioredoxin reductase 1으로부터 전자를 받는다. TRP14는 Trx1과 같은 기질을 target으로 하지 않으며, TRP14와 TRx1은 다른 기질에 활성을 가진다. crystal 구조를 비교하면, TRP14와 Trx1는 활성화자리 부근에서 전혀 다른 surface구조를 나타낸다. TRP14와 Trx1 둘다 TNF-α에 의해 자극된 세포에서 NF-κB, mitogen-activated protein kinases, apoptosis pathway를 저해하지만 서로 다른 target 단백질에 작용을 한다. TRP14는 TNF-α-induced NF-κB활성을 Trx1 보다 더 저해한다. Dynein light chain LC8은 TRP14의 disulfide reductase 활성의 새로운 target으로 정의되었다. LC8은 산화환원에 의존적인 방법으로 IκBα에 결합해서 IκB kinase에 의한 인산화를 막게 한다. TRP14와 Trx1 모두 포유동물 조직에 여러 곳에서 발현되어지며, 특히 신장, 자궁, 췌장 그리고 간에서 많이 발현된다. 이미, 신장에서 Trx는 ischemia/reperfusion 상해로부터 보호하는 기능을 가지고 있다고 보고된바 있다. 이에 반해, TRP14는 산화적 스트레스에 대해 다양하게 반응하지만, 신장내에서 위치와 기능에 대해서는 조사된바 없다. 그래서 첫번째 부분에서 TRP14의 기능을 연구하기 위해서, 우리는 siRNA interference방법을 이용하여 TRP14 형질전환 마우스를 만들었으며, 신장조직은 immunohistochemistry와 정제된 TRP14와 Trx1의 항체로 immunoblot 분석을 위해서 process되었다. 마우스의 신장에서 TRP14와 Trx는 특정한 작은 관에서 발현되어 지며, 발현 양식이 유사하다. Immunohistochemistry 실험을 위해서 aquaporin marker를 이용하였으며, TRP14와 Trx은 proximal tubule와 collecting ducts에서 위치함을 알았다. TRP14의 신장 내 특별한 기능을 알아보기 위해서 우리는 형질전환 마우스의 phenotype을 조사하였고, 나이에 따라 획득된 serum 와 urine을 분석하였다. 그 결과 나이가 든 TRP14 형질전환 마우스에서 BUN와 creatinine 의 증가를 확인하였다. 이 사실은 TRP14가 신장 내에서 기초적인 기능에 있어서 중요한 역할을 함을 암시한다. 우리는 나이가 든 TRP14 형질전환 마우스에서 H&E 염색을 통해서 비정상적인 모양의 작은 관을 관찰하였다. 비정상적인 관을 전자현미경을 이용하여 자세히 살펴 보았다. 나이가 든 TRP14 형질전환 마우스에서 두꺼워진 사구체기저막과 podocyte간의 결합, 미토콘드리아 손상과 autophagic vacule를 관찰하였다. 그러나 어린 나이의 TRP14 형질전환 마우스에서는 이런 현상을 관찰 할 수 없었다. 나이가 든 TRP14 형질전환 마우스의 proximal tubule에서 autophagic vacule가 증가된 원인을 조사하기 위해서 ischemia/reperfusion 상해를 준 TRP14 마우스 모델을 만들었고, 이때 autophagy marker 단백질인 LC3와 Atg5 항체를 이용하여 western blot을 수행하였다. 나이가 든 TRP14 형질전환 마우스에서 LCII/I ratio의 변화와 Atg5발현양의 증가를 확인할 수 있는데 반해, 어린 마우스에서는 이 단백질의 변화가 관찰되지 않았다. 이런 결과는 TRP14가 노화 과정에서 신장을 보호하는 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 두번째 부분에서, ischemia/reperfusion 상해가 도입된 신장에서 미토콘드리아 내의 활성산소 증가를 측정하기 위해서 amplex red assay를 우리실험에 맞게 개선시켜 적용하였고, percoll density gradient를 사용하여 마우스 신장에서 순수하게 미토콘드리아만를 분리하는 빠르면서 간단한 방법을 확립하였다. 게다가 미토콘드리아의 기능을 확인하기 위해서 마우스의 신장에서 미토콘드리아 membrane potential , complex activiey, 산소소비량, ATP 합성능력을 측정하였다. 미토콘드리아의 기능장애는 노화와 관련된 질병의 원인 중 하나이며, 나이든 마우스에서 TRP14의 역할을 알아보기 의해서 위의 방법 등을 이용하여 실험을 하였다. 세포의 신호전달에서 전달역할을 하는 H2O2와 같은 산화제는 PrxIII와 기타 다른 항산화 효소(catalase, Gpx, MnSOD)에 의해 조절된다. 그리고 미토콘드리아내에 이런 항산화 효소는 인산화, 아세틸레이션, 메틸레이션와 같은 수식을 겪으면서 당뇨, 노화, 그리고 암과 같은 질병에서 미토콘드리아이의 기능장애에서 중요한 기능을 할 것이라 예상된다. 그래서 세번째 부분에서 2D를 통해서 관찰되었던 PrxIII의 여러 spot들의 posttranslation 수식을 조사하기 위해서, peptide mass fingerprinting와 MS/MS를 이용하여 PrxIII의 여러 spot들을 분석하여서며, 그 결과 아세틸레이션과 메틸레인션과 같은 수식이 됨을 알 수 있었다. 이상의 실험을 통해서 신장내에서 TRP14와 Trx1이 같은 위치에서 발현되면서 서로 다른 중요한 역할을 함을 확인하였다. 그리고 immunohisotchemistry와 immunoblotting을 통해서 TRP14 형질전환 마우스에서 TRP14는 노화과정에서 발생하는 autophagy와 관련됨을 본 실험에서 밝혔다.;Thioredoxin-related protein 14 (TRP14), the amino acid sequence of which is 20% identical to thioredoxin 1 (Trx), is a novel 14-kDa disulfide reductase with two active site Cys residues in its WCPDC motif. Although the active site cysteine of TRP14 is sufficiently nucleophilic, its redox potential is similar to that of Trx1, and it receives the electrons from Trx reductase 1 (TrxR1) as does Trx1. TRP14 does not target the same substrate as Trx1, suggesting that TRP14 and Trx1 might act on distinct substrate proteins. Comparison of the crystal structures of TRP14 and Trx1 reveals distinct surface structures in the vicinity of their active sites. Both TRP14 and Trx1 inhibit the pathways of nuclear factor-κB (NF-κB), mitogen-activated protein kinases, and apoptosis in cells stimulated with tumor necrosis factor-α (TNF-α), but they appear to do so by acting on target proteins, some of which do not overlap. TRP14 inhibits the TNF-α-induced NF-κB activation to a greater extent than Trx1. The dynein light chain LC8 was identified as a new target of disulfide reductase activity of TRP14, and LC8 was shown to bind IκBα in a redox-dependent manner, thereby preventing its phosphorylation by IκB kinase. Both TRP14 and Trx1 seem to be ubiquitously expressed in mammalian tissues, being most abundant in the kidney, uterus, pancreas, and liver. Previously, the function of Trx in kidney was reported that the medullary thick ascending limb-specific retention of Trx may have a protective effect against renal ischemia/reperfusion injury (55). On the other hand, although TRP14 is known to be induced in response to various forms of oxidative stress, the cellular localization and functional role of this protein in the kidney have not been fully investigated. In the first part of current study, to study the function of TRP14, we generated transgenic knockdown (KD) mice by siRNA interference and kidney tissues were processed for immunohistochemistry and immunoblot analysis using purified anti-rTRP14 and anti-hTrx1 antibodies. Both TRP14 and Trx1 protein were expressed in specific renal tubular profiles. Interestingly, the expression patterns of TRP14 was very similar with those of Trx1 in the mouse kidney. Immunohistochemical studies using aquaporin(AQP) markers identified that both TRP14 and Trx1 are primarily localized in the proximal tubule and medullary collecting duct. To discover a kidney specific role of TRP14 compared with Trx1, we investigated phenotype of transgenic mice for determining role of TRP14 and analyze chemistry parameters of serum and urine prepared from young and old aged TRP14 mice. The results showed that statistically significant alteration in BUN and plasma creatinine was observed in old (18 months) aged TRP14 KD mice. Its facts may reflect that TRP14 may play a fundamental function in kidney. We prepared serial renal section from 18 months maintained wild type and TRP14 KD mice and observed cortex region with minimal abnormality tubules by H&E stain. To characterize affected tubules in detail, we performed study of this region using electron microscopy. 18 months old aged TRP14 KD mice were observed thickening glomerular basement membrane and extensive fusion of the podocyte, mitochondrial damage, and autophagic vacuole in proximal tubule. However, These were little changes in kidney structure and function in young TRP14 KD mice. To investigate cause of increased number of autophagic vacuoles in the proximal tubule cells of the old aged TRP14 KD mice kidney, we generated model I/R injury induced TRP14 mice and confirmed the induction of autophagy by ischemia reperfusion stress using LC3 and Atg5 western blotting. In the kidney from old aged mice, conversion of LC3-I to LC3-II and increased expression of Atg5 was apparent. In contrast, almost no conversion was detected in the young kidney. These findings suggest that TRP14 may play an important role in protecting kidney during normal aging process. In the second part, we developed Amplex Red assay methods to measure increased mitochondrial ROS in I/R injury induced kidney and established a rapid simple method for the isolation of relatively uncontaminated intact mitochondria fro perfused mouse kidney by the use of a discontinuous density gradient of iso-osmotic Percoll. Furthermore we tried to measure mitochondrial membrane potential, mitochondrial complex activity, oxygen consumption, and ATP production in kidney. Because mitochondrial dysfunction is one of causes of age-related diseases, we used these methods to discovery role of TRP14 in old aged mice. Oxidants such as H2O2 plays an important role as a secondary messenger in the initiation and amplification of cell signaling and H2O2 in mitochondria was regulated by Prx III and other antioxidant proteins (catalase, Gpx, MnSOD). Mitochondrial protein might undergo protein modification such as phophorylation, acetylation, and methylation and these modification were related a key role for mitochondrial dysfunction in diabetes, aging, various neurodegenerative disorders, and cancer. In the third part, to investigate posttranslational modifications of Prx III detected multiple spots on two dimensional gel electrophoresis, we analyzed Prx III peptide sequences containing modification as such acetylation and methylation by peptide mass fingerprinting and MS/MS of peptide.