Roles of Arrest-Defective Protein - 1 in the Tumorigenesis

Abstract

Roles of Arrest-Defective Protein-1 in the Tumorigenesis Arrest-defective protein-1 (ARD1), which was initially identified as an N-acetyltransferase in yeast, is involved in the regulation of cell cycle and sporulation. Previously, it was reported that mammalian ARD1 proteins include three mouse (mARD1198, mARD1225, and mARD1235) and two human (hARD1131 and hARD1235) variants. The mouse ARD1225 variant is known to promote HIF-1α degradation by acetylating Lys 532. The human and mouse ARD1235 variants bind and acetylate β-catenin and thereby increase the cancer cell proliferation. In this study, I found that ARD1 variants have different functions in tumor development. mARD1225 has antitumor and antiangiogenic activities through degradation of HIF-1α, which leads to downregulation of VEGFA expression. Whereas hARD1235 led to increase tumor formation through enhancing cell proliferation. To evaluate these observations, I performed following experiments; 1) mARD1225 effect on tumorigenesis in three different tumor models, 2) role of hARD1235 in the regulation of cell proliferation and tumor development. PARTⅠ. Roles of Arrest-Defective Protein 1225 and Hypoxia Inducible Factor-1α in Tumor Growth and Metastasis Angiogenesis is essential for tumor growth and metastasis. VEGFA, a critical mediator of tumor angiogenesis, is a well-characterized target of HIF-1. The murine Arrest Defective Protein-1 (mARD1)225 acetylates HIF-1a, triggering its degradation. Here, I demonstrate that mARD1-mediated degradation of HIF-1a leads to VEGFA repression, and blocks tumor progression in vivo and endothelial cell activation in vitro. Furthermore, mARD1225 overexpression suppresses the formation of intestinal tumors in ApcMin/+ mice, growth of primary tumor, and lung nodule formation in an experimental model of lung metastasis. Mutation of Lys532, the acetylation site of HIF-1a, prevents degradation of the protein, thus abrogating the anti-tumorigenic effect of mARD1225. These findings collectively implicate a tumor suppressive function of mARD1225 via HIF-1a degradation and consequent downregulation of VEGFA. PARTⅡ. Roles of Arrest-Defective Protein 1235 in Cell Proliferation and Tumor Development Acetylation is one of the most common protein modifications that regulate normal cell functions and affect tumor development. ARD1 has Nα- and Nε-acetyltransferase activity. Recently, it was reported that human ARD1 homolog (hARD1235) was associated with cell proliferation and apoptosis. However, the role of hARD1235 in tumor development remains unclear. In this study, it was showed that hARD1235 overexpression increases the formation of intestinal tumors in ApcMin/+ mice. Furthermore, the growth of transplanted tumors was significantly reduced in mice injected with ARD1 targeted ES cells than in mice injected with control cells. Also, cell growth was increased in hARD1235 –overexpressing 293T cells. Moreover, ARD1 targeted ES cells or mARD1225 -expressing ARD1 targeted ES cells decreased cell proliferation, compared with that in control ES cells. On the other hand, hARD1235 -expressing ARD1 targeted ES cells was proliferated at a rate similar to the control ES cells. These findings collectively implicate a tumor promoting effect of hARD1235 via up-regulation of cell proliferation. Conclusion These findings collectively suggest that ARD1 variants differentially modulate tumorigenesis. mARD1225 accelerates the degradation of HIF-1a, which leads to VEGFA repression, resulting in the strong inhibition of tumorigenesis and angiogenesis. In contrast, hARD1235 promotes the tumor development via increase of cell proliferlation. Differential function in tumorigenesis of these two ARD1 variants may be associated with different target proteins. Accordingly, further investigations to find ARD1 target proteins will provide important molecular clues for therapeutic intervention in human cancer.;Arrest defective protein-1 (ARD1)은 N-acetyltransferase의 활성을 가진 효소로, 세포주기 및 sporulation 조절에 관여하는 것으로 효모에서 처음 보고되었다. 최근 연구에 의하면 ARD1은 생쥐에서는 세 종류 (mARD1198, mARD1225, mARD1235), 인간에는 두 종류 (hARD1131, hARD235)의 variant가 존재한다고 알려졌다. 생쥐에서 밝혀진 ARD1225의 경우, HIF-1α의 532번째 라이신 잔기를 아세틸화시켜, HIF-1α 단백질의 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 반면 사람 및 생쥐에서 밝혀진 ARD1235는 β-catenin에 결합하여 아세틸화시키고 그 결과 암세포의 증식을 촉진시키는 역할을 한다고 보고되었다. 본 연구에서는 암의 발달에 있어서 ARD1 variants가 서로 다른 기능을 가질 것으로 예상되어 ARD1 variants의 역할을 조사하였다. 신생혈관 형성은 종양의 성장 및 전이에 있어서 매우 중요하다. 종양 내부의 신생혈관 형성 조절에 있어 중요한 인자로 HIF-1α에 의해 전사가 조절되는 혈관세포 성장인자(VEGFA)가 잘 알려져 있다. HIF-1α는 mARD1225에 의해 아세틸화되어 분해가 된다. 본 연구의 첫 번째 part에서는 HIF-1α 단백질을 아세틸화시켜 분해되게 하는 mARD1225가 많으면 저산소증 상태에서도 HIF-1α의 분해가 촉진되어 혈관세포 성장인자 생성이 줄어들어 암세포의 성장 및 전이가 억제되는 현상을 발견하고, mARD1225의 작용기전을 규명하였다. 대장암 모델동물인 ApcMin/+ 마우스와 암 성장 및 전이 마우스 모델을 이용한 실험에서 mARD1225가 과발현하였을 때 ApcMin/+ 마우스의 장에 생긴 종양의 수가 감소 하였으며, 사람 위암세포주와 마우스 흑색종세포주에서 유래한 종양의 성장과 전이가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. mARD1225는 HIF-1α 단백질의 532번째 아미노산인 라이신(K)을 아세틸화하여 분해를 촉진하는데, HIF-1α 단백질의 532번째 아미노산 라이신을 아르기닌으로 바꾼 HIF-1αK532R 단백질이 발현되는 암 세포주에서 mARD1225가 많아도 HIF-1αK532R 단백질이 분해되지 않아 mARD1225에 의해 억제되었던 암세포의 전이가 다시 촉진되는 것을 관찰하였다. 결론적으로 본 연구에서 mARD1225 유전자는 HIF-1α 단백질이 분해 및 VEGFA 생성의 감소를 통해 암의 성장 및 전이를 억제시키는 역할을 하는 것을 증명하였다. 아세틸화는 정상 세포의 기능 및 종양발달 조절에 있어서 중요한 단백질 변형으로 알려져 있다. ARD1은 Nα-및 Nε-아세틸화효소로 역할을 한다는 것이 보고되었다. 최근, hARD1235는 세포의 성장 및 세포사멸에 관련되어 있다고 보고되었지만, 종양의 발달에 있어서 hARD1235의 역할은 잘 알려지지 않았다. 본 연구의 두 번째 part에서는 암의 발달과 조절에 있어서 ARD1235의 생체 내 기능에 대해 알아보고자 하였다. 대장암 모델동물인 ApcMin/+ 마우스를 이용한 실험에서 hARD1235가 과발현하였을 때 ApcMin/+ 마우스의 장에 생긴 종양의 수가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 더욱이 ARD1 유전자적중 ES 세포주를 이용한 teratoma 형성 실험 결과, 정상 ES 세포주에 비해 ARD1 유전자의 발현이 제거된 ARD1 유전자적중 ES 세포주를 이식하여 생성된 종양의 성장이 감소되는 것을 관찰하였다. 또한, 293T 세포주에 hARD1235를 과발현하였을 때 세포의 성장이 유의적으로 증가 하였으며, ARD1 유전자적중 ES 세포주 및 이 세포주에 mARD1225를 재발현시켰을 경우에는 정상 ES 세포주에 비해 성장이 감소되는 것을 관찰하였다. 반면에 ARD1 유전자적중 ES 세포주에 hARD1235를 재발현시켰을 때에는 정상 세포주와 비슷한 세포 성장을 보였다. 결론적으로 본 연구에서 hARD1235 유전자는 세포의 성장을 조절함으로써 암 성장을 촉진시키는 역할을 하는 것을 증명하였다. 위의 결과들을 종합해 보면, 종양 형성 및 발달 조절에 있어서 ARD1 variants가 서로 다른 기능을 하고 있는 것을 알 수 있었다. 즉, mARD1225는 HIF-1α 단백질 분해를 통해 VEGFA의 발현이 감소되고, 암 성장 및 혈관형성을 억제하는 역할을 한다. 반면에, hARD1235는 세포성장을 증가시켜 암 발달을 촉진하는 역할을 하는 것으로 보인다. 따라서 종양 형성 및 발달에 있어서 ARD1 variants간의 다른 역할은 다른 표적단백질과의 상호 작용에 의해 일어나는 것으로 예상이 된다. 그러므로 앞으로 ARD1 variants의 표적단백질 스크리닝을 통해 ARD1 variants의 기전을 분석하는 것과 다양한 기능연구가 더욱 필요하며, 이를 통해 암치료제로서의 가능성을 제시할 수 있을 것이다.