Functional Switching of TGFβ1 Signaling in Liver Cancer via DNA Methylation of a Single CpG Site in TTP Promoter

Abstract

세포가 TGFβ1의 항증식 효과에 대한 선택적인 저항성을 획득하는 것은 악성 종양으로의 진행에 있어서 상당히 중요하다. 암세포가 TGFβ1의 항암적 반응으로부터 탈피를 가능하게 하는 기작들 중 하나는 c-Myc의 높은 mRNA 축적에 있다. 암세포에서 TGFβ1의 반응에 의한 c-Myc mRNA 억제 조절의 결핍은 TGFβ1 신호 전달 전체가 차단됨으로써 전사 단계에서 가능하거나, c-Myc mRNA 분해를 선택적으로 저해함으로써 전사 후 단계에서 가능하다. TTP (Tristetraprolin, ZFP36, TIS11, 또는 NUP475)는 c-Myc과 같은 AU rich element (ARE)를 포함하는 mRNA들을 분해하는 전사 후 조절자이다. 이 연구에서는 TTP의 발현 양상과 그 후성유전학적 상태, 그로 인한 TGFβ1의 반응성을 간암 세포주와 간암 환자 조직에서 조사하였다. TTP는 정상 간 조직과 비교하여 간암 세포주(10/11)와 간암 조직(19/24)에서 발현이 억제되어 있음을 알 수 있었다. CpG island인 전사 시작점으로부터 -600부터 +878bp 구역의 90 CpG들 중에서 -500 cytosine인 한 곳의 CpG만이 간암 세포주들과 간암 조직들에서 현저히 methylation되어 있었다. 그 CpG 자리는 TTP 전사 조절 부위 중 TGFβ1-반응 부위(TRR)에 위치하였고, 간암 세포주들과 간암 조직들에서의 TTP 발현 억제와 상당한 연관(r=-0.606383, P<0.001)이 있었다. 하나의 메틸화된 CpG 자리에는 MECP2/c-Ski/DNMT3A로 구성된 전사 억제 complex가 특이적으로 결합하고 있었으며, TTP의 기본 발현과 TGFβ1에 대한 발현 증가를 억제하였다. 그 특이적인 CpG 자리는 TTP 전사 조절 부위를 가진 외부 vector를 transfection하였을 때 핵에서 methylation되었고, single knockdown 실험에서는 demethylation이 되지 않았지만 DNMT1나 DNMT3A에 대한 shRNA를 이용한 두 종류의 shRNA를 모두 사용한 double knockdown에서는 demethylation되었다. TGFβ1의 target 유전자인 PAI-1과 SMAD7의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, TGFβ1에 의한 TTP 발현 증가의 결핍은 TGFβ1 신호 전달 체계의 결여에 의한 것이 아니라는 것을 알 수 있었다. TTP의 후성유전학적 억제는 c-Myc down-regulation과 TGFβ1의 항증식성 효과를 감소시켰다. SK-Hep1 세포에 과발현시킨 TTP는 c-Myc mRNA에 직접적으로 결합하였고, c-Myc down-regulation과 p21Cip1의 induction을 통한 세포 성장 속도가 감소한 것은 TGFβ1의 항증식성과 유사하게 만들었다. 반면, shRNA를 사용한 PLC/PRF/5 세포에서의 knock-down은 TGFβ1 처리 후 c-Myc mRNA의 반감기를 24분에서 51분으로 증가시켰고, TGFβ1의 항증식성을 억제하였다. 간암 환자에서 TTP promoter의 특정 methylation과 c-Myc mRNA의 양은 통계적으로 의미 있는 상관성을 보여주었다. 결론적으로, 우리는 일부 간암에서 TTP의 발현은 전사 조절 부위의 TRR 안에 위치한 특이적인 하나의 CpG 자리의 methylation으로 인해 억제되어있다는 것을 보여주었다. 또한, 특이적인 하나의 CpG 자리 methylation은, TGFβ1에 의한 TTP 발현 증가의 결핍과 이로 인한 c-Myc mRNA의 전사 후 조절 결핍, 및 p21Cip1 발현 억제 지속을 유도함으로써, 암 세포가 TGFβ1의 항증식성 반응에 대한 저항성을 획득하도록 한다는 사실을 보여주었다. TTP의 후성학적 억제를 통한 c-Myc의 전사 후 조절의 붕괴는 TGFβ1의 항증식성 반응에 선택적 저항성을 갖는 새로운 기작을 제공하였을 뿐 아니라, 암에서 TGFβ1의 신호를 암 억제에서 암 촉진으로 전환하는 후성학적 기작을 제공하였다. ;Acquisition of selective resistance to the anti-proliferative effect of TGFβ1 is crucial for the malignant progression of cancers. One of the mechanisms in cancers to escape the tumor suppressive response to TGFβ1 involves high-level accumulation of c-Myc. Loss of c-Myc down-regulation in response to TGFβ1 in cancers can be achieved at the transcriptional level by blocking entire TGFβ1 singnaling pathway and also at the posttranscriptional level by selectively inhibiting c-Myc mRNA degradation. TTP (Tristetraprolin, ZFP36, TIS11, or NUP475) is a negative posttranscriptional regulator of AU rich element (ARE)-containing mRNAs, including c-Myc. In this study, the expression profile of TTP with an epigenetic status and its implication on the responsiveness to TGFβ1 were examined in hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines and patient tissues. TTP was down-regulated in HCC cell lines (10/11), compared to normal liver, as well as in tumor tissues (19/24) from paired HCC specimens. A single CpG site (-500 cytosine from the transcription start site (TSS)) among 90 CpG sites in a CpG island of TTP consisting -600 bp to +878 bp from TSS was exclusively methylated in HCC cell lines and patient tumor tissues. The specific CpG site was located within the TGFβ1-responsive region (TRR) of the TTP promoter and was significantly associated with TTP down-regulation in both HCC cell lines and tumor tissues (r=-0.606383, P<0.001). The singly methylated CpG site was specifically bound by a transcriptional repressor complex consisting of MECP2/c-Ski/DNMT3A, and abolished the TGFβ1-induced as well as basal-level expression of TTP. The specific CpG site was de novo methylated in nuclei immediately after transfection of an exogenous TTP promoter vector into SK-Hep1 cells, while the methylated CpG was demethylated by double knockdown using shRNA of DNMT1 and DNMT3A but not by single knockdown. The loss of TGFβ1-induced TTP expression was not due to the inactivation of TGFβ1 signaling per se since the marker genes of TGFβ1 pathway such as PAI-1 and SMAD7 were clearly induced in response to TGFβ1. The epigenetic inactivation of TTP led to loss of c-Myc down-regulation in response to TGFβ1 and its cytostatic effect. Ectopically expressed TTP in SK-Hep1 cells directly bound to c-Myc mRNA and mimicked the anti-proliferative effect of TGFβ1 though down-regulation of c-Myc expression and cell growth inhibition by releasing p21Cip1 repression. On the other hand, shRNA-mediated knock-down of TTP in PLC/PRF/5 cells significantly increased c-Myc mRNA half-life from 24 minutes to 51 minutes after TGFβ1 treatment and blocked the anti-proliferative activity of TGFβ1. Statistically significant correlations were observed between the specific methylation of TTP promoter and mRNA levels of c-Myc in clinical samples of HCC. In conclusion, TTP is frequently down-regulated in HCC via methylation at a specific single CpG site located within the TRR of the promoter. The single CpG site methylation led to loss of TGFβ1-mediated TTP induction, defective posttranscriptional regulation of c-Myc mRNA, and sustained repression of p21Cip1 expression, thereby suppressing the anti-proliferative effect of TGFβ1 on tumor cells. Abrogation of the posttranscriptional regulation of c-Myc via the epigenetic repression of TTP presents a novel mechanism for the gain of selective resistance to the anti-proliferative signaling of TGFβ1 and an epigenetic mechanism for functional switching of TGFβ1 signaling in cancers from tumor suppression to tumor promotion.