A Functional Genomic Analysis of Cold Stress Response in Rapeseed

Abstract

유채는 십자화과에 속하는 중요한 작물로 한계온도에 의한 재배지의 한정이라는 문제를 가지고 있다. 국내 유채 품종의 저온 내성 정도는 내한, 산동채, 유달, 영산, 탐미 순으로 나타났다. 이들 다섯 유채 품종에 대한 저온 초기 반응의 분자적 배경을 이해하기 위하여 애기장대 Coldstresschip을 사용하여 이들의 유전자 발현을 분석하였다. 애기장대와 Brassica 종은 계통학적으로 매우 가까우며 그들 유전자 사이에 염기 서열 유사성이 높아 애기장대 마이크로어레이 사용이 가능하다. 저온 스트레스 처리시 국내 유채 5품종의 유전자 발현 양상의 상관성을 hierarchical clustering 방법으로 조사한 결과 내한과 산동채, 유달과 애기장대가 유전자 발현 양상이 비슷하였다. 저온 처리한 유채와 애기장대는 저온초기에 비생물학적 스트레스(abiotic stress), 전사 인자(transcription factors), 단백질 합성, 아미노산 대사에 관여하는 유전자들이 공통적으로 현저하게 유도되는 반면 광합성, 탄수화물 대사, 지질대사, 호르몬 대사, 2차대사, 신호전달에 관여하는 유전자들이 차별적으로 발현되었다. 애기장대와 유채는 계통발생적으로 유사하고 초기 이들 유전자의 차별적 발현으로 인하여 저온에 대한 내성에 차이를 보여줄 것이다. 유채의 저온 초기 반응으로부터 얻어진 결과를 바탕으로 저온 스트레스에서 동시발현 유전자 세트 (co-expression gene sets) 와 저온 초기 네트워크를 이용하여 GSEA 분석을 도입함으로써 저온 민감성 식물체에 저온 내성 강화에 에 기여할 유전자 세트를 진단 결과, 저온 내성이 약한 영산과 탐미에 비해 내성이 강한 내한 품종에서 글루다치온 황 전이효소 (Glutathione S transferase), 비생물학적 스트레스, 칼슘과 수용체 키나아제 (receptor kinase) 와 같은 신호 전달, 가수분해효소활성 (hydrolase activity)을 통한 차이가 차별적 내성에 큰 기여를 하였으며, 이들 유전자 세트는 카드뮴, 염, 저온, 삼투 스트레스, 물 부족, 독소 이화과정 (toxin catabolic process), 신호 전달과 지방산 생합성의 복합적인 생물학적 기능을 가진다. 이들 저온 스트레스에 강한 내한 품종에서 차별적으로 발현되는 유전자 세트 중에서 다른 스트레스와 복합적으로 관계하여 내성을 강화 할 수 있는 유전자를 얻기 위하여 cross-talk 지도에 적용하여 분석하였다. 이 결과를 바탕으로 AtGST2, AtTRXh5, LTI30, AtLACS4 유전자를 우선적으로 선발하였다. 각 유전자에 대한 발현 자료를 비교 분석하여 선발한 유전자가 실제적으로 저온 민감성과 관련이 있는지를 판단하기 위하여, 애기장대에서 해당 유전자가 결손 되었을 때 저온에 대한 민감성이 변하는지 조사하였다. 각 유전자에 대한 돌연변이는 ABRC 종자은행으로부터 구입한 해당 유전자가 결손된 식물체를 이용하였으며 4가지 유전자 모두가 애기장대에서 민감도가 증가하였다. 이들 확인한 결과를 바탕으로 네가지 유전자 중 AtGST2와 AtTRXh5의 저온 스트레스에 대한 보다 심층적인 분석을 위하여 기능을 분석하기 AtGST2와 AtTRXh5가 과다발현되는 형질전환 식물체를 제작하여 이들의 저온에 대한 내성을 연구하였다. 그 결과 이들 식물체는 저온 스트레스에 강화되었다. 저온에 대한 AtTRXh5의 기능을 분석하기 위하여 동시발현지도에서 이웃 유전자 (neighboring gene)을 분석한 결과, AtTRXh5는 세포질에서 상처, 건조, 삼투 와 저온 스트레스에 관련하여 발생하는 활성 산소종을 독성완화 시키며 감염된 세포의 programmed cell death에 대한 저항성을 가질 것이다. 티오레독신은 그들의 이웃 유전자와 상호 작용하여 식물 세포의 항산화 네트워크를 이루어 독소 조절에 관여 할 수 있다. AtTRXH5 와 AtGSTF2는 저온 스트레스를 포함하는 항산화 네트워크에 신호 경로에 관여하는 구성 요소로 활성 산소를 제거하는 메카니즘 조절자로서 역할을 한다 따라서 이들 유전자는 저온 스트레스를 포함하는 환경 스트레스 강화에 기여 할 것이다.;Rapeseed (Brassica napus L.) is an important seed crops belong to the Brassicaceae family. However, rapeseed cannot be cultivated under some certain temperature boundaries so have cultivation limit. Analysis of cold tolerance among the 5 Korean rapeseed cultivars was performed, and the cold tolerance is revealed as follows; Naehan ≥ Sandongchae >Yudal ≥ Arabidopsis > Youngsan > Tammi. To understand molecular backgrounds in early response to cold stress of 5 cultivars in Korean rapeseed (Naehan, Sandongchae, Yudal, Youngsan and Tammi), gene expression profiles during the process of cold stress were analyzed using cold specialized Arabidopsis cDNA microarrays based on the fact that Arabidopsis and Brassica species are phylogenetically related very closely, and their sequence similarities between homologous genes are high. A comparative result of gene expression profile during the cold stress was consistent with gene expression pattern according to the hierarchical clustering pattern among the 5 rapeseed cultivars. Patterns of gene expression of Naehan in the cold stress were similar to those of Sandongchae. Patterns of gene expression in Yudal were also similar to those in Arabidopsis. The genes involved in abiotic stresses such as cold and drought/salt, transcription factors like AP2/EREBP, C2H2, bHLH, BZIP, and WRKY, and protein synthesis were induced most abundantly in those cold treated rapeseed and Arabidopsis. Arabidopsis and rapeseed are closely related, the initial response genes were differentially regulated. The genes involved in photosynthesis, major carbohydrate metabolism, lipid metabolism, hormone metabolism, secondary metabolism, redox and signaling were differentially expressed between Arabidopsis and rapeseed. Therefore, difference in gene expressions may contribute to the different capabilities of cold tolerance. To understand the cold stress responses of rapeseed, the cold network model for early cold stress response was studied, using Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) for co-expression gene sets. Thus the comparisons in early cold responses and the findings of the gene sets which contribute to cold tolerance in cold sensitive plants were conducted. The results form comparative analysis showed that network gene sets matching in Naehan from contributed to the differential cold sensitivity of rapeseed. These co-expressed gene sets include glutathione S transferase, abiotic stress, signaling such as calcium and receptor kinase, fatty acid synthesis, hydrolase activity, and redox regulation were highly enriched in Naehan when these were compared with Youngsan and Tammi, Therefore, these gene sets still have biological functions including those responses to cadmium, salt, cold, osmotic stress, water deprivation, water, toxin catabolic process, signal transduction, and fatty acid biosynthetic process. To obtain complex-stress tolerance enforceable genes, among enriched gene sets in cold tolerance Naehan was adopted into cross-talk map and then was analyzed. Based on the results, those AtGSTF2, AtTRXh5, LTI30, and AtLACS4 genes were preferentially selected. To confirm whether those selected genes, which after the individual analysis of gene expression, are substantially related with cold sensitivity, the changes in cold sensitivity of each gene omitted Arabidopsis were investigated. By using knock-out mutant plants purchased from the ABRC seed bank, all of those selected gene knock-out was found to increase the sensitivity. According to the observed results, further functions against cold stress of the AtGSTF2 and AtTRXh5 were analyzed and those AtGSTF2 and AtRXh5 gene over-expressed plants were produced so as to obtain more information on cold resistance. As the results, those produced and tested plants were strengthened against cold stress. According to the observed neighboring gene on the co-expression map in the function analysis of TRXh5 against cold, cytosolic TRXh5 would detoxify ROS which resulted from wounding, dehydration, osmotic and cold stresses and would give the resistance of infected cells from programmed death. The TRXh5 may also be able to regulate some toxicants by establishing an antioxidant networks in plant cells through the cooperation with neighboring genes. However, the AtGST2 and AtTRXh5 are the intermediary components of signaling pathways in cold stress-involved anti-oxidation network, and they play roles as the regulators of ROS scavenging mechanism. Therefore, these genes would contribute the enhancement of tolerance against those environmental stresses as well as cold stress.