알코올 대사 효소 저해제와 알코올성 고지혈증 억제 상관관계 연구

Abstract

In this study, we studied bioactive compounds inhibiting alcohol induced hyperlipidemia. 4-Methylpyrazole (4-MP), N-acetyl-L-cysteine (NAC), quercetin and herbal mixture Rx58 were used as bioactive compounds. Acute or chronic alcohol intakes are related with alcoholic hyperlipidemia, alcoholic fatty liver, hepatic fibrosis, cirrhosis or hepatitis. An alcoholic fatty liver or hyperlipidemia is the most common response of the liver in heavy alcohol use. We focused on the protection of liver against alcohol induced fatty liver and hyperlipidemia by bioactive compounds. The main system of alcohol metabolism is composed of alcohol dehydrogenase (ADH) in the cytosol, aldehyde dehydrogenase (ALDH) in the mitochondria and cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) in the microsome of the liver. Acetaldehyde, lipid peroxide and reactive oxygen species (ROS) produced in alcohol metabolism in the liver have been suggested as possible pathogenic factors. Acetaldehyde is known as a potent pathogenic factor in these alcohol related syndromes. Alcohol dehydrogenase is reversible in alcohol metabolism. In order to inhibit the production of acetaldehyde, alcohol dehydrogenase inhibitors might be employed. 4-MP, NAC, quercetin and herbal mixture Rx58 were tested as alcohol dehydrogenase inhibitors. In order to block the backward reaction and to enhance alcohol oxidation (forward reaction), acetaldehyde trapping agent might be employed. L-Cysteine and NAC were tested as acetaldehyde trapping agents. In order to reduce alcohol induced CYP2E1-dependent oxidative stress, antioxidants might be employed. NAC and quercetin were tested as free radical scavengers. The in vitro effects of 4-MP, NAC, quercetin and herbal mixture Rx58 on the cytosolic fraction, mitochondrial fraction and/or microsomal fraction of the liver from a male Sprague Dawley rat were studied. Based on in vitro activities, the in vivo effects of 4-MP, NAC, quercetin and herbal mixture Rx58 on alcohol concentrations in blood and lipid profiles were studied in male Sprague Dawley rats. The doses of 4-MP were 2.5, 5.0 and 10.0 ㎎ per ㎏ of body weight; NAC were 8.9, 17.8 and 35.6 ㎎ per ㎏ of body weight; quercetin were 11.6, 23.3 and 46.5 ㎎ per ㎏ of body weight and herbal mixture Rx58 were 4.5, 9.1 and 18.1 ㎎ per ㎏ of body weight, respectively. The ethanol and acetaldehyde concentrations in blood, saliva (person's alcohol drinking experiment) and urine were analyzed by using headspace sampler-gas chromatography. And also, the alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high density lipoprotein (HDL) and low density lipoprotein (LDL) in the serum were analyzed. In 4-MP administrated rats, ethanol concentration remained at a high level not only in blood but in urine. In NAC, quercetin, and herbal mixture Rx58 administrated rats, ethanol concentration remained at a high level in blood. Co-administration of ethanol with 4-MP (5-10 ㎎/㎏) reduced levels of ethanol-induced AST, ALT and TG. However, the HDL cholesterol value was increased. Co-administration of ethanol with NAC (8.9-17.8 ㎎/㎏) reduced levels of ethanol-induced AST, ALT, TC, TG and LDL cholesterol. However, the HDL cholesterol value was dose-dependently increased. Co-administration of ethanol with quercetin (11.6-46.5 ㎎/㎏) reduced levels of ethanol-induced AST, ALT, TC and TG. The AST, ALT and TG values were dose-dependently decreased. Co-administration of ethanol with herbal mixture Rx58 (4.5-18.1 ㎎/㎏) reduced levels of ethanol-induced AST, TC, TG and LDL except ALT at 18.1 ㎎/㎏. However, the HDL cholesterol value was dose-dependently increased. The effective concentrations of 4-MP, NAC and quercetin and herbal mixture Rx58 were 5.0, 17.8, 23.3 and 9.1 ㎎ per ㎏ of body weight, respectively. This study suggests that 4-MP, NAC and quercetin and herbal mixture Rx58 prevent alcoholic fat accumulation and the bioactive compounds alleviate alcohol induced toxic effects on liver and lipid metabolism.;본 연구에서는 알코올 대사 효소들에 작용하는 물질들의 알코올에 기인하는 고지혈증 억제 효과를 규명하였다. 연구 대상 물질로는 4-methylpyrazole, L-cysteine, N-acetyl-L-cysteine, quercetin 및 생약 혼합 추출물을 사용하였다. 알코올은 간의 세포질 내 알코올 탈수소효소, 미토콘드리아 내 알데히드 탈수소효소, 소포체 (마이크로좀) 내 에탄올 산화 효소계의 cytochrome P450 2E1 및 과산화소체 내 catalase에 의해 대사된다. 장기적인 알코올 섭취로 알코올성 지방간, 알코올성 고지혈증, 간섬유증, 간경화 및 간염 등의 간질환이 생길 수 있다. 그 가운데 알코올성 간질환의 가장 일반적인 형태는 알코올성 지방간 또는 알코올성 고지혈증이다. 알코올성 간질환이 발생하는 기전은 다양하지만, 그 중에서 주된 요인은 알코올 대사 과정에서 생성되는 아세트알데히드, 활성산소 및 자유라디칼이라 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 알코올 대사 효소들에 작용하는 물질들을 이용하여 알코올성 고지혈증 및 알코올성 지방간 억제 효과를 확인하고자 하였다. 아세트알데히드는 알코올 산화 과정에서 생성되는 중간 생성체로서 갈증, 발한, 피부발열, 전신권태, 피로감, 기억상실, 복부팽만감, 소화불량, 오심, 구토, 설사, 두통, 심계항진 등을 유발한다. 따라서 아세트알데히드가 원인이 되는 알코올성 고지혈증을 억제하고자 알코올 탈수소효소 저해제로 알려져 있는 4-methylpyrazole(4-MP, fomepizole)을 이용하여 실험하였다. 4-MP와 에탄올을 투여하여 혈중 알코올 농도가 에탄올만 단독 투여할 때보다 증가함을 확인하였고, 뇨 중 알코올 및 아세트알데히드 함량을 분석하여, 뇨 량과 뇨 중 알코올 양이 증가함을 확인하였다. 또한 쥐 간 또는 혈청에 대하여 간 손상의 지표 효소인 AST (aspartate aminotransferase)와 ALT (alanine aminotransferase) 및 총콜레스테롤 (TC, total cholesterol), 중성지방 (TG, triglyceride), 고밀도지단백콜레스테롤 (HDL, high density lipoprotein), 저밀도지단백콜레스테롤 (LDL, low density lipoprotein)을 포함하는 지질 양 (lipid profiles)을 분석하였다. 에탄올과 4-MP (5-10 ㎎/㎏) 동시 투여로 에탄올을 단독으로 투여할 때 관찰되는 AST, ALT 활성 증가, TG 증가, HDL 양의 감소 등의 현상을 억제하는 효과를 확인하였다. 이들 결과로 4-MP가 알코올 산화반응을 선택적으로 저해하여 아세트알데히드의 생성을 억제하며, 혈중 알코올은 뇨를 통해 배설됨으로서 아세트알데히드의 간세포 손상도 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 중성지방의 축적 등을 억제함으로서 간 비대 또는 지방간의 형성과 고지혈증의 발생을 억제하는 효과를 초래할 것으로 추정할 수 있었다. 알코올 탈수소효소는 가역효소 (reversible enzyme)이다. 독성이 강한 아세트알데히드는 매우 빨리 대사된다. 그러므로 알코올 탈수소효소에 의해 생성된 아세트알데히드가 축적되면 알코올 탈수소효소의 기질로 작용하여 역반응이 진행된다. 따라서 아세트알데히드 소거제로 알코올 탈수소효소의 역반응을 억제하여 알코올 대사촉진을 기대할 수 있다. 알코올 탈수소효소의 시간에 따른 정반응의 변화와 역반응에 대한 영향을 실험하여 L-cysteine과 N-acetyl-L-cysteine (NAC)의 아세트알데히드 소거 효과를 확인하였다. 활성산소 및 자유라디칼은 알코올 탈수소효소나 알데히드 탈수소효소 등의 탈수소효소들의 반응으로 인하여 체내의 산화 환원 상태가 붕괴되어 환원력이 고갈되거나, 에탄올 산화 효소계의 cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) 등의 직접적 산화 효소의 작용으로 생성된다. 생성된 활성산소 및 자유라디칼에 의해 단백질이 산화, 효소 불활성화 및 과산화지질 등이 형성되어 알코올성 지방간 및 알코올성 고지혈증이 발생한다. 그러므로 항산화 활성이 기대되는 NAC와 quercetin을 에탄올과 동시에 투여하여 에탄올 투여로부터 발생되는 현상들에 대한 영향을 실험하였다. 또한, 한방에서 전통적으로 사용되어 온 천연물 가운데 알코올 탈수소효소 활성 저해 효과가 있는 가시오가피, 갈근, 감초, 계지, 대조, 백출, 상백피, 인삼으로 혼합 생약 처방을 구성하여 ‘Rx58’이라 명명하고 이를 실험에 이용하였다. L-Cysteine, NAC 및 Rx58은 알코올 탈수소효소를 저해하여 아세트알데히드의 생성을 억제하였고, 에탄올에 의해 증가한 CYP2E1 활성 (112.5%)은 NAC(109.4%) 및 Rx58 (107.7%)이 저해함을 확인하여 산화적 스트레스에 의한 간 손상 예방에 적합할 것으로 유추할 수 있었다. NAC 또는 Rx58과 에탄올을 투여하여 혈중 알코올 농도가 에탄올만 단독 투여할 때보다 증가함을 확인하였다. 에탄올 투여로 증가한 간 조직 중 TG 비율은 NAC 17.8 ㎎/㎏, quercetin 46.5 ㎎/㎏ 및 Rx58 9.1 ㎎/㎏의 체중 용량으로 에탄올과 동시 투여할 때 가장 유의성 있게 감소하였다. NAC (8.9-17.8 ㎎/㎏)와 에탄올의 동시 투여로 에탄올을 단독으로 투여할 때 관찰되는 AST, ALT 활성 증가, TC, TG, LDL 양의 증가, HDL 양의 감소 현상을 억제하는 효과를 확인하였다. Quercetin (11.6-46.5 ㎎/㎏)과 에탄올의 동시 투여로 AST, ALT 활성과 TC, TG 양의 감소 현상을 확인하였고, 특히 에탄올 투여에 의해증가된 AST, ALT 활성과 TG의 양은 quercetin의 농도에 의존적으로 감소하였다. 생약 혼합 추출물 Rx58 (4.5-18.1 ㎎/㎏)과 에탄올의 동시 투여로 AST 활성 증가, TC, TG, LDL 증가, HDL 감소 현상을 억제하는 효과를 확인하였다. 쥐 간 또는 혈청의 AST, ALT 및 총콜레스테롤, 중성지방, 고밀도지단백콜레스테롤, 저밀도지단백콜레스테롤 양에 있어, 4-MP 5 ㎎/㎏, NAC 17.8 ㎎/㎏, quercetin 23.3 ㎎/㎏ 및 Rx58 9.1 ㎎/㎏의 체중 용량으로 투여했을 때에 여섯 가지 시험 항목에서 에탄올 투여에 의해 증가 또는 감소 (HDL) 현상을 억제하여 가장 유효한 농도로 결정하였다. 효소 실험 및 동물 실험 결과를 바탕으로 건강한 소수의 지원자를 대상으로 생약 혼합 추출물 HM Rx58에 대한 혈액, 타액 또는 뇨 중 알코올 및 아세트알데히드 농도 변화를 분석하였다. 10명의 건강한 지원자들에 대해 생약 혼합 추출물 Rx58을 이용한 음주 임상 실험을 실시하고 혈액, 타액, 뇨의 알코올 및 아세트알데히드 농도를 분석하여 아세트알데히드의 뇨 중 농도와 타액 중 농도가 대조실험에 비해 증가함을 확인하였다. 이 결과 알코올 대사에 의해 생성되는 아세트알데히드의 뇨 중 배설과 타액 배설 증가에 의해 체내 아세트알데히드 축적을 방지함으로서 아세트알데히드를 경유한 음주 후 부작용 및 독성을 줄일 수 있음을 확인하였다. 이상의 결과들로부터, 알코올성 간질환을 일으키는 요소들의 조절 물질에 관한 추가적인 음주 임상 실험을 통한 연구를 보강하면 음주 효과는 유지시키면서 음주로 인한 알코올성 고지혈증과 지방간 등의 간질환을 예방하거나 개선하는 의약품 또는 식음료의 개발에 적극 활용될 수 있을 것이다.