Antitumor activity of natural products magnolol and timosaponin A-III in human colon cancer cells

Abstract

본 연구에서는, 대장암에서 과발현 되어있는 Wnt signal 에 대한 후박 유래한 물질인 magnolol의 저해효능을 평가하고 그 작용기전을 확인하였으며, 지모유래 물질인 timosapopnin A-Ⅲ의 대장암 세포 증식 억제 효능을 평가하고 그 작용기전을 확인하였다. 우선, 천연물로부터 유래한 158종에 대한 b-catenin/TCF 전사억제 효능을 평가하여, 가장 우세한 효과를 보인 후박 유래 물질 magnolol 의 Wnt signal 억제 효능을 여러 in vitro 실험모델에서 평가하였으며, 그 작용기전 연구를 실시하였다. Magnolol은 HEK293 세포에 실험적으로 b-catenin을 도입하여 증가된 b-catenin/TCF 전사 표적유전자의 발현을 상대적으로 낮은 농도인 25 mM에서 원래의 발현정도로 회복시켰다. 또한 HEK293-hFz1 세포에 Wnt 처리하여 증가된 b-catenin/TCF 전사 및 그 표적유전자의 발현을 농도의존적으로 저해하였다. 이러한 결과를 바탕으로 magnolol이 비정상적으로 활성화된 Wnt signal을 정상으로 되돌릴 수 있다고 생각된다. Magnolol은 유전자의 변이에 의해 Wnt signal이 과활성화 되어있는 대장암 세포주 SW480과 HCT116에서도 b-catenin/TCF 전사활성 및 그 표적유전자 발현을 저해하였다. Wnt signal의 일부 표적유전자는 세포 증식을 촉진하므로, magnolol의 세포증식 저해효능을 SW480 및 HCT116 세포에서 평가하였다. 그 결과 magnolol은 두세포 모두에서 농도 및 시간 의존적으로 세포성장을 저해했으며, HCT116 xenograft 모델에서도 대조군에 비해 54.6%의 암세포증식 저해 효능을 나타내었다. 이는 SW480 및 HCT116 세포에 대해 magnolol의 성장저해 효능이 Wnt signal을 하향조절함으로써 나타날 수 있음을 암시한다. Magnolol의 b-catenin/TCF 전사활성 억제기전을 확인하기 위해 세포질 및 핵내의 b-catenin 단백질 발현정도를 Wnt에 의해 활성화된 HEK293-hFz1 및 SW480 세포에서 확인한 결과, magnolol은 두세포 모두에서 세포질과 핵분획의 b-catenin의 발현을 저해하였으며, Wnt에 의해 활성화된 HEK293-hFz1 세포에서 현미경을 통해 형광 표지된 b-catenin 발현을 확인한 결과 magnolol은 핵과 세포질 모두의 b-catenin발현을 저해하는 것으로 나타났다. 또한 SW480 세포에서 magnolol은 TCF의 표적 DNA 결합을 저해하였다. 이 결과는 magnolol이 세포질내 b-catenin 축적을 저해하므로 b-catenin의 핵내로의 이행을 저해하여 b-catenin/TCF 전사활성을 억제하였음을 나타낸다. Magnolol은 Wnt에 의해 활성화된 HEK293-hFz1, SW480, 및 HCT116 세포에서 b-catenin 과 결합함으로 b-catenin/TCF 전사를 억제하는 것으로 알려진 E-cadherin의 발현을 유도하였는데, 이는 세포질 내 b-catenin저해와 연관이 있을 것으로 여겨진다. SW480세포에 b-catenin의 siRNA를 도입한 결과 그 하향표적 유전자인 cyclin D1과 c-myc의 발현이 저해되었는데, 이를 통해 cyclin D1과 c-myc이 b-catenin 에 의해 발현조절을 받는 것을 확인할 수 있었으며, magnolol을 처리한 결과 고농도에서 남아있는 cyclin D1이 저해된 것으로 보아 고농도의 magnolol은 Wnt 의존적, 또는 비의존적으로 cyclin D1을 저해함을 확인하였다. 또한, HCT-15 대장암 세포주에서 지모 유래 물질 4종의 세포증식 저해효능을 평가한 결과 timosaponin A-Ⅲ의 효능이 가장 뛰어났으며, 72시간 처리시 6.1 mM의 IC50값을 나타내었다. FACS 분석법에 의하여 timosaponin A-Ⅲ의 처리에 따른 세포의 주기형태 변화를 관찰한 결과, 10 mM 이하의 농도에서 timosaponin A-Ⅲ은 HCT-15 세포의 G0/G1기 및 G2/M기의 진행 억제를 유도 하는것으로 나타났으며, 상대적으로 높은 농도인 20 mM 에서 timosaponin A-Ⅲ은 세포사멸도 유도하는 것으로 확인되었다. Timosaponin A-Ⅲ에 의한 세포주기 억제는 cyclin A, cyclin B, cdk 4 및 c-myc 와 같은 세포주기 조절 단백질 발현의 감소와 pRb의 탈인산화와 관련이 있는 것으로 확인되었으며, timosaponin A-Ⅲ의 세포 사멸 유도 작용은 fragmented DNA가 확인됨으로 apoptosis에 의한 것임이 확인되었다. Timosaponin A-Ⅲ은 bcl-2와 bcl-XL과 같은 antiapoptotic protein의 발현을 저해하고, 또한 caspase류를 활성화시키고 poly(ADP-ribose) polymerase의 cleavage를 유도하여 apoptosis를 유발하는 것으로 여겨진다. 추가로 pRb 발현의 감소도 apoptosis 와 연관이 있는 것으로 추정된다. 이 외 in vivo에서 timosaponin A-Ⅲ의 복강내 투여에 따라 HCT-15 xenograft의 성장저해가 농도의존적으로 유도되었다. 대조군과 비교하여 유의적인 몸무게 감소의 부작용은 나타나지 않았다. 지금까지의 결과를 종합해 볼 때, 대장암에 대해 magnolol 과 timosaponin A-Ⅲ은 항암효능을 갖는 천연물 유래 항암제 개발을 위한 선도물질로서 가능성이 제시된다.;Natural products have played an important role in the discovery of cancer chemotherapeutic and chemopreventive agents. In this study, the growth inhibition of magnolol derived from Magnolia obovata Thumb (Magnoliaceae) on cancer cells was evaluated and its mechanism of action was employed with Wnt signaling pathway. In addition, the antiproliferative and antitumor effects of timosaponin A-Ⅲ derived from Anemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae) were also investigated in human colon cancer cells. Natural products have played an important role in the discovery of cancer chemotherapeutic and chemopreventive agents. In this study, the growth inhibition of magnolol derived from Magnolia obovata Thumb (Magnoliaceae) on cancer cells was evaluated and its mechanism of action was employed with Wnt signaling pathway. In addition, the antiproliferative and antitumor effects of timosaponin A-Ⅲ derived from Anemarrhena asphodeloides Bunge(Liliaceae) were also investigated in human colon cancer cells. In early events of colorectal carcinogenesis, abnormal activation of Wnt/b-catenin and up-regulation of b-catenin/T-cell factor (TCF) response to transcriptional signaling play a critical role. In this study, we examined the effect of magnolol, a biphenolic component from the cortex of M.obovataonaWnt/b-catenin signaling. Employed in our assay was HEK293 human embryonic kidney cells that were transient transfected with b-catenin, TCF4 and TOPflash genes; the TOPflash activity was determined. Magnolol effectively suppressed the TOPflash activity with the IC50valueof10.7mM. To further investigate the mechanism of action related to the regulation of b-catenin signaling in human colon cancer cells, SW480 human colon cancer cells were treated with magnolol for 24 h. Magnolol inhibited nuclear translocation of b-catenin. The gene expression levels of c-myc, MMP-7 and uPA which are b-catenin/TCF targeted downstream genes, were significantly decreased in a dose-dependent manner as analyzed by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction in SW480 and HCT116 human colon cancer cells. Magnolol also exhibited the antitumor activity in HCT116 xenograft nude mouse model. These findings suggest that the growth inhibition of magnolol against human colon cancer cells was in part attributed to the regulation of Wnt/b-catenin signaling pathway. Timosaponin A-Ⅲ isolated from the rhizoma of A. asphodeloides has shown anti-hemolysis, anti-platelet aggregation and vasodilation. In this study, we investigated the effect of timosaponin A-Ⅲ on the growth inhibitory activity in cultured human colon cancer cell line HCT-15. An anti-proliferative assay using sulforhodamine B revealed that timosaponin A-Ⅲ inhibited the proliferation of cancer cells with an IC50valueof6.1mM. Flow cytometric analysis indicated that timosaponin A-Ⅲ arrested cell cycle progression in G0/G1 and G2/M phase, and induced the increase of sub-G1 peak in a concentration-dependent manner. The increase of sub-G1 peak by timosaponin A-Ⅲ was closely related to the induction of apoptosis, which was demonstrated by the induction of DNA fragmentation, activation of caspase-3, -8 and -9, and induction of cleaved poly-(ADP ribose) polymerase. In addition, timosaponin A-Ⅲ also exhibited the antitumor activity against HCT-15 xenograft nude mouse model without overt toxic effects. These findings suggest the cell cycle arrest and induction of apoptosis might be one possible mechanism of actions for the anti-proliferative activity of timosaponin A-Ⅲ in human colon cancer cells. Taken together, magnolol and timosaponin A-Ⅲ are considered as potential candidates for developing anti-tumor agents against human colon cancer. Timosaponin A-Ⅲ isolated from the rhizoma of A. asphodeloides has shown anti-hemolysis, anti-platelet aggregation and vasodilation. In this study, we investigated the effect of timosaponin A-Ⅲ on the growth inhibitory activity in cultured human colon cancer cell line HCT-15. An anti-proliferative assay using sulforhodamine B revealed that timosaponin A-Ⅲ inhibited the proliferation of cancer cells with an IC50 value of 6.1 M. Flow cytometric analysis indicated that timosaponin A-Ⅲ arrested cell cycle progression in G0/G1 and G2/M phase, and induced the increase of sub-G1 peak in a concentration-dependent manner. The increase of sub-G1 peak by timosaponin A-Ⅲ was closely related to the induction of apoptosis, which was demonstrated by the induction of DNA fragmentation, activation of caspase-3, -8 and -9, and induction of cleaved poly-(ADP ribose) polymerase. In addition, timosaponin A-Ⅲ also exhibited the antitumor activity against HCT-15 xenograft nude mouse model without overt toxic effects. These findings suggest the cell cycle arrest and induction of apoptosis might be one possible mechanism of actions for the anti-proliferative activity of timosaponin A-Ⅲ in human colon cancer cells. Taken together, magnolol and timosaponin A-Ⅲ are considered as potential candidates for developing anti-tumor agents against human colon cancer.