The effect of IL-12 priming and cholera toxin on the differentiation of T cell

Abstract

Naïve T 세포가 effector를 거쳐 memory T 세포가 되기 위해서는 T cell receptor를 통한 siganl, costimulatory signal 그리고 cytokine signal을 통한 T 세포의 활성화가 우선적으로 필요하다. 이러한 신호는 T 세포의 활성과 분화에 영향을 미치는데 특히, IL-12는 활성화된 CD8 T세포가 분화하고 생존하는데 매우 중요한 역할을 담당한다. IL-12에 의해서 anti-apoptotic molecule이 증가하고 이로 인해서 effector와 memory CD8 세포가 많이 생성됨은 알려져 있는데, 어떠한 유전자 및 조절 기작이 관여하는지에 대해서는 정확히 알려져 있지 않다. 따라서 IL-12 priming이 CD8 T세포의 활성과 증가된 생존에 미치는 메커니즘을 보기 위해서 항원에 의해 자극 받는 동안 IL-12에 의해서 조절되는 유전자와 형태를 비교해보았다. 그 결과, IL-12 priming에 의해서 long- lived memory 세포로 분화되는 CD127hi세포들이 증가되는 것을 보았고 또한 IL-12 priming은 CD8 T세포에서 IL-10 생성을 유도하게 됨을 확인하였다. IL-10은 anti-inflammatory와 immunosuppressive한 특징을 가지고 있는 cytokine으로 알려져 있지만 IL-10 priming은 apoptosis에 대한 감수성을 떨어뜨림으로써 effector와 memory CD8 T 세포의 증가를 가져왔으며 IL-12에 의해서 유도된 IL-10을 중화시키게 되면 IL-12 priming 효과가 부분적으로 감소되었다. 이러한 결과는 IL-10이 CD8 T 세포의 생존에 직접적이고 명백한 역할을 하고 있음을 보여주며 IL-12 priming에 의한 effector와 memory CD8 T 세포의 증가에 IL-10이 부분적으로 관여하고 있음을 보여주는 것이다. IL-12 priming에 효과에 관여하는 또 다른 메커니즘으로서 세포 표면에 풍부하게 발현되는 glycoprotein중 하나인 CD43가 IL-12 priming에 의해서 감소됨을 확인하였다. 활성화된 CD8 T 세포의 생존에 CD43의 발현이 미치는 영향을 보기 위해 IL-12 priming후에 CD43lo와 CD43hi세포로 분리하였고 각 세포의 기능과 생존을 비교해보았다. 그 결과 CD43lo세포는 CD43hi세포에 비해서 감소된 cytolytic activity와 낮은 granzyme B의 발현을 나타내었지만 in vivo와 in vitro 모두에서 더 잘 생존함을 보여주었고 secondary expansion 또한 잘함을 보였다. 이러한 결과는 IL-12 priming에 의해서 CD43의 발현이 down-regulation된 세포들이 보다 더 잘 생존하는 memory 세포가 될 가능성을 제시해주는 것이다. 이 연구는 IL-12 priming에 의한 effector와 memory 세포의 증가된 생성은 단순히 한 유전자나 한 조절 기작이 작용하는 것이 아니라 위의 결과처럼 CD127, IL-10 그리고 CD43의 발현 등 여러 요소들이 복합적으로 작용하여 그 효과를 나타내게 됨을 보여준다. 특히 IL-12 priming에 의한 IL-10의 생성과 CD43의 down-regulation은 progressive T cell activation 모델에서 제시하는 바와 같이 T 세포의 활성화 단계에서 signal strength를 약화시킴으로써 활성화된 T 세포가 보다 더 잘 생존함을 뒷받침해주는 근거이다. T 세포의 활성에 있어서 third signal을 제공하는 cytokine은 CD4 T 세포에 대해서는 주로 Th1, Th2 그리고 regulatory T 세포로의 분화를 결정짓는데 있어서 중요한 요소로 알려져 있다. 최근에는 IL-17을 발현하는 Th17에 대한 연구가 많이 진행되고 있는데 우리는 cholera toxin (CT)을 adjuvant로 antigen과 함께 호흡기로 면역화시키게 되면 CD4 T 세포가 주로 Th17으로 분화가 됨을 알게 되었다. 따라서, CT가 IL-17을 생성하는 CD4 T 세포로의 분화에 어떤 영향을 주는지 보았고 그 결과, CT에 의한 Th17 반응은 CT의 B subunit만을 처리했을 때도 나타나는 것으로 보아 CTB subunit에 의존적임을 알 수 있었다. 또한 CT에 의한 Th17 반응은 마우스의 genetic background에 관계없이 나타나며 폐에 neutrophil을 다량 유입시킴을 관찰하였다. In vitro와 in vivo 모두에서 CT를 처리하면 IL-6가 생성되고 IL-6 KO 마우스를 사용하면 CT에 의한 Th17 반응이 나타나지 않는 것으로 보아 IL-6가 CT에 의한 Th17 반응을 유도하는데 중요하게 작용하는 것으로 보인다. 즉, CT의 호흡기 면역화는 IL-6의 생성을 가져오고 이것은 폐에서 계속 발현되는 TGF-β와 함께 작용하여 CD4 T 세포가 Th17 세포로 분화되도록 돕는 것으로 생각되며 Th17 반응은 결과적으로 neutrophil의 유입을 가져와서 inflammation을 증가시키는 것으로 보여진다. 이 연구는 CT를 사용한 in vivo immunization을 통해 Th17 반응을 유도할 수 있음을 보여주었고 이것이 CT에서도 non-toxic하다고 알려진 B subunit에 의존적이므로 CTB를 이용하여 in vivo에서 원하는 면역반응을 유도할 수 있음을 제시해준다.;In addition to TCR and costimulatory signals, inflammatory cytokines such as IL-12 provide important signals for differentiation and survival of activated CD8+ T cells. In the present study, to investigate the mechanisms by which IL-12 priming contributes to activation and enhanced survival of CD8+ T cells, we searched the differentially regulated genes and markers by IL-12 during antigenic stimulation. Here, we show that IL-12 priming results in the increased subpopulation of CD127hi cells, which differentiates into long-lived memory cells. We also found that IL-12 priming induced IL-10 expression from activated CD8+ T cells, which is distinct from CD127 up-regulation. Direct IL-10 priming of CD8+ T cells results in a significant increase of effector and memory CD8+ T cell population after adoptive transfer, and this priming effect is closely associated with less susceptibility to apoptosis. Although IL-10 is known as a cytokine with anti-inflammatory and immunosuppressive properties, our results have shown that IL-10 reveals a direct and positive effect on the survival of CD8+ T cells. Together, we suggest that IL-10-dependent and independent effects of IL-12 play important roles in regulating differentiation and survival of activated CD8+ T cells into effector and memory cells. And also, we observed dramatically decreased expression of CD43 in activated CD8+ T cells by IL-12 priming. To determine the role of CD43 expression on the survival of activated CD8+ T cells, we purified CD43lo and CD43hi cells after IL-12 priming and analyzed the function and survival of each population. CD43lo effector CD8+ T cells exhibited reduced cytolytic activity, lower granzyme B expression and reduced IFN-γ production but showed significantly increased survival both in vivo and in vitro than CD43hi cells. Also secondary effector CD8+ T cells derived from CD43lo cells exhibited increased in vivo expansion. Together, these results suggest that IL-12-mediated CD43 expression may be involved in differentiation and survival of effector and memory CD8+ T cells.