Search for the methods to decrease extracellular actions of translationally controlled tumor protein

Abstract

Extracellular translationally controlled tumor protein (TCTP) is involved in human allergic responses by inducing histamine, IL-4, and IL-13 release from basophils and IL-8 secretion from eosinophils. TCTP has been identified outside of macrophages and activated mononuclear cells, in broncho-alveolar lavage (BAL) fluids from patients with eosinophilic pneumonia or asthma, and in nasal washings and skin blister fluids during late allergic reactions. Even though TCTP devoids of signal sequences, it is secreted to extracellular environment by not yet defined mechanism. In this study, I found that omeprazole and pantoprazole, proton pump inhibitors (PPIs), reduce TCTP export from HEK293 cells and U937 cells with a concentration-dependent fashion and the secretion of TCTP from HEK293 cells is increased when they were co-transfected with the expression vectors encoding alpha-subunit of H^(+)/K^(+)-ATPase and beta-subunit of Na^(+)/K^(+)-ATPase. I also tested whether pantoprazole has anti-allergic effects using murine model of ovalbumin-induced allergy. Pantoprazole pre-treatment reduced marked infiltration of inflammatory cells toward airway walls, hyperplasia of mucus-producing goblet cells in proximal airways, and TCTP secretion induced by OVA challenge. These results suggest that PPIs might be potential anti-allergic drugs for chronic allergic diseases, such as asthma and rhinitis. Next, I tried to make chimeric Fab fragments for TCTP using phagemid display technique. I used recombinant full TCTP and dTCTP(N11) proteins as antigens. The Fab fragments for dTCTP(N11), however, were not prepared regretfully. After biopanning, I found three clones binding to recombinant full TCTP protein with same CDR3 region in V_(H). Although they showed differences in V_(L), they had very similar amino acid sequences in CDR regions of V_(H). The plasmid DNAs from the three clones had some problems in protein induction in small scale and I could not carry out the assays for their neutralizing effects through protein induction and purification in large-scale. Optimization of protein induction and purification for the three clones is needed in the future. Although the three clones are weak binders to full TCTP they show selectivity between full TCTP and dTCTP(N11). They might be a useful tool to sort two different types of TCTP.;세포 외부에 존재하는 TCTP는 호염기구로부터 히스타민, IL-4, IL-13의 분비를 유도하고, 호산구에서 IL-8의 분비를 촉진하여 알레르기 반응에 관여한다. TCTP는 대식세포와 활성화된 단핵세포의 세포 외부, 호산구성 폐렴이나 천식 환자의 기관지 폐포 세척액, 후기 알레르기 반응 동안 얻어진 코 세척액과 피부 수포액에 존재한다고 알려져 있다. TCTP는 세포 외부로 분비되는 데 필요한 신호 서열이 없이도 아직까지 밝혀지지 않은 기전을 통해 세포 외부 환경으로 분비된다. 본 연구에서는 프로톤 펌프 저해제인 오메프라졸과 판토프라졸이 HEK293 세포와 U937 세포에서 농도 의존적으로 TCTP의 분비를 감소시키고, HEK293 세포가 프로톤 펌프의 알파 체인과 나트륨 펌프의 베타 체인을 발현시키는 벡터의 도입으로 이런 단백질을 과발현하게 되면 TCTP를 더 많이 분비한다는 연구 결과를 얻었다. 또한 마우스에 난알부민을 이용하여 알레르기 반응을 유발시킨 모델에서 판토프라졸이 항알레르기 효과를 보이는지 관찰하였다. 난알부민 유발에 의해 증가되는 염증세포의 기도벽쪽으로의 침윤과 기도에 존재하는 점액 분비 배상 세포의 증식, TCTP의 분비 현상이 판토프라졸의 전처치에 의해 감소되었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 프로톤 펌프 저해제는 천식과 비염 같은 만성 알레르기 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 항알레르기제로서의 가능성을 가지고 있는 것으로 생각된다. 다음으로, phagemid display 기법을 이용하여 TCTP에 결합할 수 있는 키메라 Fab을 만들어 보았다. 항원으로는 재조합 full TCTP와 dTCTP(N11) 단백질을 사용했다. 그러나 안타깝게도 dTCTP(N11)에 대한 Fab은 만들어지지 않았다. Biopanning 과정을 거쳐 재조합 full TCTP에 결합하면서 VH 부분에 존재하는 CDR3 아미노산 서열이 같은 세 개의 클론을 찾아냈다. 세 개의 클론은 VL 부분에서는 차이를 보였지만 VH의 CDR 부분 아미노산 서열은 비슷했다. 세 개의 클론에서 얻어진 플라스미드 DNA는 소량 단백질 생산 유도 과정에 문제가 있어서 대량의 단백질 생산과 정제를 통한 작용 무효화 성질에 대한 시험은 할 수 없었다. 앞으로 단백질 생산 유도와 정제에 적합한 조건과 과정을 찾기 위한 최적화 과정이 필요하다. 찾아낸 세 개의 클론들은 full TCTP에 대한 결합력이 약하기는 하지만 dTCTP(N11)보다 full TCTP에 더 선택성을 보이므로, 두 종류의 TCTPs를 구분하는 데 유용한 도구로 사용될 수 있을 것이다.