Post-Translational Modification (PTM) Specific Proteomics

Abstract

Post-translational modifications (PTMs) of proteins, not detected through RNA analysis, play key roles in regulation of various biological functions of protein. Due to the dynamic complexities in vivo and low abundance of PTMs, however, comprehensive identification of PTMs remains a highly challenging problem in proteomics. In this thesis, a new PTM-specific strategy, a selectively excluded mass screening analysis of unmodified peptides in LC-ESI-q-TOF MS/MS is described. Precursor ion list of unmodified peptides showing high intensity was obtained in the first run, and the exclusion of unmodified peptides in subsequent runs enabled the identifications of modified peptides presenting low intensity by MS/MS sequencing. This strategy yielded a rapid and efficient finding of comprehensive PTMs occurred in vivo. Application of this approach on glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) protein expressed in oxidized mammalian cells, gave us the information on multiple protein modifications (more than 10 types of modification on 27 sites) over 93% peptide coverage. The results show that PTMs in mammalian system in vivo are more complicated and more heterogeneous than previously reported, and this novel strategy has a great potential for examining the systematic characterization of multiple PTMs for functional proteomics. Additionally, this PTM specific proteomic technologies developed in this study are applicable for understanding various cellular biological systems. At first, intermediate filament (IF) vimentin regulation was examined in response to external stimuli. To investigate the correlation between PTMs and structural properties of IF vimentin in response to external stimuli, the proteomic analysis was performed by combination with western blot analysis. Here I present data describing PTMs of vimentin fragments isolated from the cytosolic fraction of human umbilical vascular endothelial cell (HUVEC). These data suggest that the additional covalent modification of vimentin in response to external stimuli is important for the biochemical processes such as translocation and protein-protein interaction, and this study will be useful for the study on the biological roles of other IF proteins by providing a comprehensive map of PTMs that have relevance to each particular assembly of altered structure. At the last part, specificity of hFAF1 identified in my laboratory as having UBA domain in addition to several ubiquitin related domains including UAS and UBX was examined. To investigate whether hFAF1 binds to specific ubiquitinated substrates interacting to the newly identified UBA, in vitro pull down assay using GST-hFAF1-UBA [1-81] was employed. Affinity purified polyubiquitinated proteins binding to UBA domain were separated by SDS-PAGE and identified by peptide sequencing with ESI-q-TOF tandem mass spectrometry coupled to nano-liquid chromatography. Eight proteins were identified as polyubiquitinated proteins in vitro and in vivo and the exact ubiquitinated sites were determined by selective sequencing of the peptide having ubiquitinated signature peptide at lysine residue (114.1 Da). Bioinformatic studies examining the nature of polyubiquitinated proteins interacting to UBA domain of hFAF1 provided new insights into the biological function of hFAF1. It is possible that hFAF1 may serve as a recruiting molecule of ubiquitinated proteins, which regulates calcium and zinc-related apoptosis. The results including newly developed proteomic technology will be useful for studying the PTMs and functions of proteins.;RNA 분석으로는 검출되지 않는 단백질의 post-translational modifications (PTMs)은 단백질의 다양한 생물학적인 기능에 있어서 결정적인 역할을 한다. 이러한 이유로, PTM에 대한 연구는 최근 중요한 학문분야로 대두되고 있다. 그러나, 생체 내에서 PTM 들이 매우 복잡한 과정을 통해 매우 다양한 형태로 생성되며, 그 양이 매우 미량으로 존재함으로 인해, PTM들과 biological events의 종합적인 이해는 proteomics계에서는 아직도 해결해야 할 어려운 문제로 남아있다. 이 논문에서, 우리는 이러한 PTM과 생물학적인 현상들의 종합적인 이해를 규명하고자 새로운 PTM 맞춤 식 전략(SEMSA)를 기술한다. 이 방법은2-dimensional gel electrophoresis와LC/ESI q-TOF를 이용하여 단백질을 동정 확인한 후, 그 단백질의 unmodified peptides들 즉 원하지 않는 peptides 만을 선별적으로 제거하는 방법이다. 일반적으로 LC/MS가동 시, unmodified peptide들은modified peptide 에 비해 상대적으로high intensity를 나타내게 되어, LC/MS내 data dependent system의 control하 에서는 unmodified peptides가 주로 MS/MS precursor candidates로 선택되어 상대적으로 low intensity를 나타내는 modified peptide의 경우, MS/MS sequencing으로 유도할 수 있는 precursor candidates로부터 제외되기 쉽다. 이러한 기기적, 기술적인 제한 점을 보완하고자 SEMSA방법을 이용하여, 상대적으로 낮은intensity를 나타내는 modified peptide의 MS/MS sequencing을 가능하게 하였다. 이 방법은 생체 내에서 일어나는 종합적인 PTM의 빠르고 효율적인 검출 및 외부자극 후의 단백질의 다양한 PTM의 정성 및 정량적인 고찰을 가능하게 하여, 질병 관련된PTM연구를 보다 더 종합적으로 수행하게 할 것이라 본다. 다음으로, 이 방법의 효율성을 확인하고자, 모델 단백질로서 H2O2로 산화시킨 GAPDH에 적용한 결과, 93%이상의 sequence coverage하에서 27sites에10개 이상의 다양한 종류의 PTM을 검색하였다. 이 결과로부터, mammalian system에서의 PTM은 기존의 보고된 것보다 훨씬 더 복잡하고, heterogeneous하며, 이 새롭게 개발된 기술이 functional proteomics를 가능하게 할 수 있을 것이라 사료된다. 이에, 우리는 이PTM 맞춤형 기술을 다양한 세포 내 생물계의 biological functions를 이해하는 데에 적용하고자 하였다. 그의 첫 적용으로, intermediate filament (IF) vimentin regulation은 외부로부터의 자극 후, PTM과 biological effects를 검증하였다. vimentin filament는deploymerized fraction과ploymerized fraction 사이에서 지속적인 교환을 통해 형성 되 어지는 dynamic 구조이다. 외부적인 자극 후IF vimentin의 기능과 구조적인 성질 사이의 관련성을 연구하기 위해, western blot 분석과 연합된 proteomic 분석을 수행하였다. 이 논문에서, HUVEC의cytosolic fraction으로부터 얻어진 vimentin fragments의PTM data를 보여준다. 또한, cytoskeletal network stability에서 주요한 역할을 하는 특정 peptide region 에서의 vimentin fragment cleavage의modification을 평가한다. 이들 data를 기초로 하여, 외부로부터 자극 후, vimentin의covalent modification이translocation과 protein-protein interaction같은 생화학적인 과정에 관련될 수 있음을 제시하며, 이 연구가 변형된 구조 assembly에 의미를 부여하는 PTM의 종합적인 map을 제공하므로 서, 다른 IF protein의 생물학적 역할에 관한 연구에도 유용할 것이라 생각된다. 다음으로, Fas에 결합하는 단백질로 밝혀져 있는 human fas sssociated factor 1 (hFAF1)은 세포 내에서 fas가 유발하는 세포사멸을 강화시킨다고 알려졌으나 어떠한 역할을 하는지 아직 명확히 밝혀진 바 없다. 이 연구에서는 ubiquitin-proteasome system을 매개하는 단백질들이 각자 특정한 단백질을 인식한다는 최근 보고에 의거하여 hFAF1의UBA domain에 결합하는 ubiquitination된 단백질들을 찾고자 하였다. 우선, hFAF1이 특정한 ubiquitination된 단백질과 결합하는가를 확인하기 위해 UBA domain을 포함하는 GST-tagged hFAF1[1-81]을 이용하여 in vitro pull down assay를 수행하였으며, hFAF1의UBA domain에 결합한 단백질들은 nano spray-liquid chromatography가 부착된 LC/ ESI q-TOF tandem MS/MS를 이용하여 동정 확인되었다. 그 결과8개의 ubiquitination된 단백질들이 확인되었으며, 각 단백질에서 ubiquitination의signature sequence (114.1 Da)를 가진 펩타이드들 의 아미노산 서열을 결정함으로써 정확한ubiquitination된Lys site를 밝혀내었다. 이 연구는, 해당 ubiquitination site의 mutational analysis를 통해 ubiquitin-proteasome system에서 hFAF1의 기능을 이해하는 데 도움이 될 것이다.