The functional study of adaptor proteins, LIME and LAD, in T cell-mediated inflammatory response

Abstract

T 세포는secondary lymphoid organ에서 antigen을 만나 활성화 및 증식하여 효과 (effector) T세포로 분화 한다. 일단 분화된 effector T세포는 chemokine신호에 의하여 염증부위로 migration하여, T세포에 의한 면역반응 유발 및 감염된 antigen의 제거에 결정적으로 작용한다. 이 과정에서 면역세포 특이적으로 발현되는 adaptor protein이 단백질-단백질 결합을 매개 함으로서 신호전달에 관여하는 것이 잘 알려져 있다. 본 논문에서는 면역세포 특이적으로 발현되는 adaptor protein 의 일종인 LIME 과LAD의 T세포에서의 기능을 연구하였으며, 그 결과 LIME및 LAD단백질이 chemokine receptor를 통한 신호전달에 관여하며, 따라서 T세포의 migration 및 면역반응 유발에 필수적임을 밝혔다. 현재까지 LIME은 T 세포주에서 TCR을 통한 신호전달에 관여하여 T 세포 활성을 유도함이 알려져 있었으나 동물수준에서 LIME의 생물학적인 기능은 연구된 바가 없었다. 따라서 본 논문의 첫 번째 장에서는 LIME 의 유전자를 제거한knockout (LIME^(-/-)) mice를 제작하여 형질을 분석하였다. LIME^(-/-) mice유래의 naive T 세포는 T세포수용체 (TCR) 자극 시 proliferation, IL-2 생성 및 effector T세포로의 분화가 정상이었으며, 따라서 LIME은 naive T세포 활성화 및 분화에는 크게 관여하지 않는 것으로 생각되었다. 그러나 T 세포가 effector T 세포로 분화함에 따라 특이적으로 LIME의 발현이 점차 증가함이 관찰되었다. 이에 근거하여 LIME은 naive T 세포에서 보다는 분화된 effector T 세포에서 중요한 기능을 담당할 것으로 가정하였으며, 이를 검증하기 위해 LIME^(-/-) mice를 이용해 T cell에 의해 유도되는 염증반응 실험을 수행하였다. LIME^(-/-) mice에서는 wild type (WT)에 비해 delayed-type hypersensitivity (DTH) response와 contact hypersensitivity (CHS) response와 같은 염증반응이 현저히 저하되었으며, 또한 염증부위로 migration된 leukocyte의 수 역시 크게 감소되어 있었다. 또한, in vitro에서 분화시킨 LIME^(-/-) Th1 세포는 WT Th1 cell과 비교 시, IP-10 및 RANTES와 같은 pro-inflammatory chemokine을 통한 migration이 크게 저하되어 있었다. 이와 같은 결과는 LIME이 chemokine receptor를 통한 신호전달경로에 관여하여 T 세포를 통해 유도되는 염증 반응에 필수적임을 시사한다. Chemokine receptor를 통한 신호전달에 있어서 LIME의 역할을 규명하기 위해 in vitro에서 분화시킨 Th1 cell에서 chemokine처리 시 신호전달에 관여하는 단백질들의 활성을 연구하였다. 그 결과, LIME은 chemokine을 통한 MAPK 및 PI3K pathway에는 크게 관여하지 않으나, Rac1 및 Rap1와 같은 small GTPase의 활성화를 유도 함으로서 actin reorganization 및cell polarization에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었다. 또한 chemokine 을 통한 ADAP 의 인산화에 LIME이 필요한 것으로 보아 chemokine을 통한 inside-out signaling에 LIME이 관여할 가능성이 있다. 이상의 결과를 종합하면, LIME은 chemokine receptor를 통한 신호전달을 증폭시킴으로써 T cell의 migration을 유도하고, 따라서 T cell에 의해 유도되는 염증반응에 필수적인 역할을 수행함을 알 수 있다. 두 번째 장에서는 chemokine receptor를 통한 신호 전달 과정에서 adaptor 단백질인LAD의 기능을 연구하였다. LAD는 yeast-two-hybrid를 통해Lck에 결합하는 단백질로서 처음 발견되었으며 LAD를 bait로 한 yeast-two hybrid assay 를 통하여 LAD는 G protein β subunit (Gβ) 과 결합 하는 것으로 알려졌다. 면역세포에서 대표적인 G protein-coupled receptor는 chemokine receptor이므로 본 연구에서는chemokine receptor를 통한 신호 전달과정에서 LAD의 기능을 연구하였다. 우선, Jurkat T 세포주에서 siRNA를 이용하여 LAD의 발현을 억제하였을 때, SDF-1α와 RANTES과 같은 chemokine을 통한 T 세포의 migration이 크게 감소함을 관찰하였다. 이와 같은 결과는 LAD가 chemokine receptor를 통한 신호전달에 관여하여 cell migration에 필수적인 역할을 담당함을 의미한다. 다음 단계로 chemokine 신호전달과정에서 LAD의 작용 기작을 연구하였다. 지금까지 chemokine에 의해Lck및 ZAP-70와 같은 tyrosine kinase가 활성화되고, 이것은 T 세포의 migration에 필수적임이 기존 연구를 통해 잘 알려져 있으나, 어떻게 이들 kinases가 chemokine receptor가까이 위치하게 되는지는 알려진 바가 없었다. 따라서 LAD가 이들 kinases의 recruitment에 관여할 가능성을 조사하였다. Jurkat T 세포주에서 chemokine처리시 LAD는 Gβ 와 직접 결합하고, 동시에 Lck 및 ZAP-70와 결합하는 것이 관찰되었다. 또한 Jurkat T 세포주에서 siRNA로 LAD의 발현 억제 시, chemokine을 통한ZAP-70의 인산화가 저해됨이 관찰되었으며, 또한 Pyk2 및 Paxillin과 같은 focal adhesion complex 단백질의 인산화에도 LAD가 필수적임을 관찰하였다. 이러한 결과는 chemokine receptor 신호 전달과정에서 Gβ-LAD-Lck/Zap70 단백질complex형성을 통해 LAD가 chemokine receptor 를 통한 Lck와 ZAP-70의 활성화에 필수적이며, 그 하위 단계에서 작용하는 chemokine신호전달에 관여하는 여러 단백질의 활성화에도 LAD가 필수적임을 보여주는 것이다. 결론적으로 본 논문에서는 LIME과 LAD가 chemokine signaling을 통한 T 세포의 migration 유도에 필수적인 adaptor protein임을 정립하였고, 또한 생물학적 기능 및 신호전달 메커니즘을 규명하였다. LIME 과 LAD는 공히 면역세포 특이적으로 발현되고, 염증반응에 참여하는 활성화 된 T 세포에서 그 발현 양이 특히 증가되는 특징을 고려할 때, 이들 단백질은 분화된 효과 T세포-특이적인 신호전달을 매개하는 주요 adaptor로서 염증반응에 필수적인 역할을 할 것으로 생각된다.;The generation of antigen-specific T cells and their migration to the peripheral inflammatory sites are important for the elimination of pathogens from the body. In these processes, adaptor proteins are critical components in transducing externally applied signals from the cell surface into the intracellular environment. Among the adaptor proteins, LIME (Lck-interacting membrane protein) and LAD (Lck-associated adaptor protein) are found uniquely as binding partners of Lck tyrosine kinase. However, their biological functions are not fully elucidated. Thus, in this thesis, I investigated the novel functions of adaptor proteins, LIME and LAD in T cell-mediated immune responses. In Chapter I, to elucidate the physiological function of LIME, I characterized the phenotype of LIME^(-/-) mice. Any significant abnormality in organ development and lymphocyte population is not found in LIME^(-/-) mice. However, the experiments of delayed-type hypersensitivity response and contact hypersensitivity response reveal that T cell-mediated inflammation is significantly reduced in the absence of LIME, which is accompanied with the impaired leukocyte infiltration in the lesion. In addition, the adaptively transferred LIME^(-/-) T cells elicit significantly reduced inflammation in CHS response compared to WT T cells, suggesting that LIME^(-/-) T cells are intrinsically impaired in effector functions. Subsequent in vivo and in vitro assays demonstrate that LIME plays critical roles in chemokine-mediated T cell migration to the local inflammatory sites. The impaired migration of LIME^(-/-) Th1 cells was accompanied with the impaired cell polarization with lack of lamellipodia and filopodia at the leading edge and uropod. Based on these observations, signaling pathways downstream of LIME were investigated. LIME^(-/-) Th1 cells have defects in RANTES- or IP-10-dependent activation of small GTPases such as Rac1 and Rap1, and ADAP phosphorylation, which are required for actin polymerization and migration. These results implicate that LIME may participate in the chemokine-mediated signaling pathways by regulating cytoskeleton reorganization. Taken together, I present here the novel function of LIME in chemokine signaling pathways in effetor T cells and the biological importance in T cell-mediated inflammatory response. In Chapter II, I have investigated the novel function of LAD in chemokine signaling and T cell migration. LAD was previously identified as an adaptor protein involved in TCR-mediated T-cell activation. Recently, the G protein betta subunit (Gbetta) has been identified as a LAD-binding partner. Based on this information, I investigated whether LAD is involved in chemokine signaling, since the most well-known G protein-coupled receptor in T cells is the chemokine receptor. When endogenous LAD expression was suppressed by transfecting siRNA-expressing plasmid, Jurkat T cells showed significantly reduced migration capacity toward both homeostatic chemokine, SDF-1? and inflammatory chemokine, RANTES. This result indicates that LAD is required for chemokine-induced T-cell migration. Subsequent investigation of the signaling pathways revealed that, in response to chemokine, LAD associates with the tyrosine kinases Lck and Zap-70 and that LAD is essential for the chemokine-induced Zap-70 phosphorylation. Moreover, LAD is required for the chemokine-dependent tyrosine phosphorylation of focal adhesion molecules including Pyk2 and Paxillin. Taken together, the present work addresses LAD as an adaptor protein that links the G protein betta subunit to the tyrosine kinases Lck and Zap-70, and subsequent recruitment of the downstream effector molecules, thereby mediating chemokine-mediated T-cell migration. Since it is found that tyrosine-phosphorylated LIME associates with SH2 domain of LAD, and the expression of both LIME and LAD is increased upon T cell activation, they may function together in effector T cells, potentiating T cell-mediated inflammatory response. All together, the findings presented in Chapter I and Chapter II provide a new insight into the signaling cascades for the chemokine-dependent T cell migration, which is mediated by adaptor proteins, LIME and LAD.