Signaling mechanisms leading to B cell activation and differentiation through the surface molecule, CD40

Abstract

CD40는 TNFR 계에 속하는 세포 표면 단백질로서 CD40에 의한 신호전달은 생체 면역반응에 중요한 역할을 담당한다. 특히, CD40를 통한 신호는 B 임파구에서 궁극적으로 전사 인자를 조절하여 세포의 활성화, 성숙화 및 분화 과정에 기여한다. 그러나 이러한 중요성에도 불구하고 CD40에 의한 B 임파구의 고유기능이 조절되는 명확한 기전은 아직 밝혀져 있지 않은 상태이다. 본 논문은 B 임파구의 활성화 및 분화를 유도하는 CD40를 통한 신호를 크게 세부분으로 나누어 연구하였다. 첫번째 연구는 CD40 수용체에 의한 활성 산소종의 생성기전에 관한 내용이다. 이전의 연구 결과는 CD40 자극에 의해 WEHI 231 B 임파구 세포주에서는 NADPH oxidase경로를 통해, Raji B 임파구 세포주에서는 5-LO 경로를 통하여 각각 활성산소종이 생성되고, PI3-K 단백질의 활성이 두가지 경로에 모두 관련되고 있음을 밝혔다. 또한 이러한 활성 산소종이 CD40에 의한 p38 MAPK 활성화에 second messenger로서의 역할을 담당하고 있음을 밝혔다. 본 연구에서는 CD40 자극에 의한 활성 산소종의 생성과 이로 인한 p38 MAPK 활성화를 사람의 말초 혈액에서 얻어낸 B 임파구 (PBLs) 안에서 검사하였다. 그 결과, 세포주에서의 실험 결과와는 달리 NADPH oxidase와 5-LO에 의한 두가지 경로 모두가 CD40 자극에 의한 활성 산소종의 생성과 이로 인한 p38 MAPK 활성화 과정에 관여하고 있음을 알게 되었다. 또한 이러한 결과는 활성화된 마우스의 B 임파구에서도 관찰되었다. 즉, 마우스 B 임파구가 활성화되면 5-LO 단백질의 발현이 크게 증가할 뿐 아니라, CD40에 의한 활성 산소종의 생성에도 NADPH oxidase와 5-LO에 의한 경로 모두가 관여될 수 있음을 제시하고 있다. 또한, 단백질들의 상호 작용에 관한 연구를 통해 PI3-K의 regulatory subunit인 p85가 CD40 및 5-LO단백질과 직접 결합함으로써 CD40 자극에 의한 활성 산소종 생성을 위한 signaling complex 형성을 매개한다는 사실을 발견하였다. 두번째 연구는 사람의 제대혈 B 임파구에서 CD40 자극에 의해 유도되는 신호전달에 관한 내용이다. 골수 이식과 비교해 볼때, 제대혈 이식 후 B 임파구의 기능이 느리게 회복되며 특히, 다양한 종류의 면역 글로불린 (Ig)이 생산되지 않는다고 보고된 바 있다. CD40 수용체에 의한 신호전달이 Ig isotype switching에 중요하기 때문에 본 실험에서는 제대혈 B 임파구들의 CD40 신호전달이 비정상적일 가능성을 예측하고 이를 시험하였다. 즉, 제대혈, 골수, 그리고 말초 혈액에서 각각 추출한 B 임파구내에서 세포 표면 수용체에 의한 MAPK 활성화를 비교하였다. 그 결과, 제대혈 내의 B 임파구 subest 들은 BCR에 의한 MAPK 활성화는 정상적으로 일어나지만, CD40에 의해서는 상당히 손상되어 있음을 발견하였다. 본 연구에서는 이러한 손상된 신호전달의 원인을 규명하고자 여러가지 가능성들을 시험하였다. 그 결과, CD40에 의한 신호전달에 관련된 단백질들의 발현은 세가지 source의 B 임파구에서 비슷하게 나타났지만, flow cytometry 결과로부터 memory B 임파구와 transitional B 임파구의 특정 subset이 제대혈 내에 거의 존재하지 않음을 발견하였다. CD40 자극에 의한 MAPK 활성화가 주로 이러한 특정 subset들에서 강하게 유도되기 때문에, 이들 특정 B 임파구 subset들의 상대적인 결여가 제대혈 B 임파구에서 정상적인 CD40 반응이 일어나지 못하는 이유를 설명할 수 있으리라 예상된다. 세번째 연구는 CD40 자극에 의해 유도되는 p190RhoGEF 단백질의 기능을 통해 B 임파구의 활성화, 성숙화 및 분화 과정의 신호전달이 조절될 수 있다는 내용이다. 이전의 연구에서 RhoA를 특이적으로 활성화하는 p190RhoGEF가 CD40 자극에 의해 그 발현이 증가하는 단백질들 중의 하나로 발견되었으며. 또한 p190RhoGEF 혹은 CA 형태의 RhoA 단백질이 과 발현 되었을 때, CD40 자극이 없어도 B 임파구의 활성화가 유도될 수 있음을 보고한 바 있다. 본 연구에서는 이러한 결과들을 통해 p190RhoGEF 단백질이 CD40를 통한 B 임파구의 성숙화 과정에 관여될 수 있음을 예측한 후, 성숙화 단계가 다른 B 임파구들에서의 p190RhoGEF의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, 성숙화된 B 임파구에서 p190RhoGEF 단백질의 발현이 증가되어 있으며, 이러한 발현 양상은 항체를 생산하는 세포에서 많이 발현되는 syndecan-1과 같은 세포 표면 단백질과 Blimp-1과 같은 전사 인자들의 발현 양상과 일치한다는 사실을 발견하였다. 또한, 이러한 표면 단백질 및 전사 인자들은 미성숙 B 임파구에서는 CD40 수용체가 활성화될 때 그 발현이 유도되었지만, p190RhoGEF WT 또는 CA 형태의 RhoA 단백질을 과 발현시킨 세포주에서는 CD40에 의한 활성화 없이도 그 발현 정도가 성숙한 B 임파구에서와 유사하게 증가되어 있었다. 뿐만 아니라, 이러한 단백질 과 발현 세포주들에서 IgM 또는 IgG 항체의 분비 역시 증가되어 있음을 발견하였다. 이러한 결과들을 통해 p190RhoGEF 단백질이 B 임파구가 항체 생산 세포로 분화하는 과정에 관련되어 있음을 예측할 수 있었다. 본 실험에서는 또한 WT과 DN 형태의 p190RhoGEF 형질전환 마우스에서의 B 임파구 subset 비교, T 임파구 의존적 항원 반응 등의 분석을 통해, p190RhoGEF 단백질이 CD40 자극에 의해 유도되는 GC B 임파구 형성부터 항체 생산 세포로의 분화 및 면역기억 세포로의 분화 과정에도 관여할 수 있음을 확인하였다.;The tumor necrosis factor receptor superfamily member, CD40, is expressed on a variety of cells. In B cells, the CD40 signaling is essential for activation and proliferation of B cells by T cell-dependent antigen, germinal center formation, Immunoglobulin (Ig) class switching, affinity maturation of B cells, and the development of plasma or memory B cells. The ligation of CD40 induces multiple signaling pathways including protein kinase cascades, and the activation of the MAPKs such as JNK and p38, which ultimately lead to activation of transcription factors. However, further studies are required to understand how CD40 signaling regulates B cell functions. In this thesis, CD40-mediated signaling mechanisms leading to B cell activation and differentiation are studied in three different aspects. The first chapter describes the ROS production pathways that are involved in CD40-mediated signaling. Previously, it has been shown that the CD40 stimulation generates ROS by NADPH oxidase and 5-lipoxygenase (5-LO) pathways in WEHI 231 mouse B cells, and Raji human B cells, respectively, and PI3-K activity is involved in both CD40-mediated ROS production pathways. The ROS acted as second messengers in the CD40-induced p38 MAPK activation. In the present study, the mechanism of ROS production and the involvement of CD40-induced p38 activation were determined in human peripheral blood B cells (PBLs). Unlike the results from the B cell line experiments, both NADPH oxidase and 5-LO pathways play roles in the CD40-stimulated ROS production and p38 activation in human PBLs. Similar results were obtained in activated mouse splenic B cell followed by the upregulation of 5-LO. Studies of molecular associations demonstrated that 5-LO is recruited to CD40 receptor following CD40 ligation through the interaction with p85, and that p85 directly interacts with CD40 and 5-LO via its SH3PBP and C-SH2 domains, respectively. These results may indicate that both NADPH oxidase and 5-LO pathways play roles in CD40-induced ROS generation in B cells. The second chapter presents the characterization of distinct B cell subsets and CD40-induced MAPK activation in cord blood (CB), bone marrow (BM) and peripheral blood (PB). Compared to BM transplantation, a slow recovery of B cell function after CB transplantation, especially, secretion of Ig with various isotypes has been reported. Since CD40 signaling is important for Ig isotype switching, the CD40-mediated MAPK activation was examined in CB, BM, and PB. The activation of ERK and p38 MAPK was normal after ligation of BCR, but significantly impaired after CD40 ligation in B cells from CB. Expression levels of signaling molecules that are involved in CD40-mediated signal transduction were examined in B cells isolated from CB, BM, and PB. The population of B cell subsets was also compared by flow cytometry in these three sources. Although expression levels of the signaling molecules were found to be comparable in B cells from all three sources, there were distinct differences in the B cell subsets of CB. Flow cytometry data showed that CB contained a little or none of the memory B cells and the specific subset of transitional B cells, the populations which normally induce a great response of MAPK activation following CD40 ligation. These results may explain in part the impaired CD40 responses in B cells from CB. The third chapter explains the function of p190RhoGEF in the B cell maturation, and differentiation followed by the CD40-induced B cell activation. Recently, p190RhoGEF, a novel RhoA-specific GEF, has been identified as one of the proteins that are remarkably increased in their expression following CD40 stimulation in WEHI 231 B cells and mouse splenic B cells. Overexpression of p190RhoGEF or a constitutively active form of RhoA mimicked the effects of CD40 stimulation such as changes in cellular structure and NF-??B activation. Since these results suggest a possibility that p190RhoGEF may function in the B cell maturation followed by the CD40-induced B cell activation, expression of p190RhoGEF was compared in B cell lines originated from different stages in maturation. P190RhoGEF was expressed constitutively high in mature B cell lines, CH12.LX and BAL17. Expression of surface molecules, such as syndecan-1 (CD138) and CXCR4, and transcription factors such as Blimp-1, XBP-1 and IRF4, which are known to regulate plasma cell differentiation in B cell development stage, was also constitutively high in these B cells. In contrast, the expression of these surface molecules and transcription factors was induced in WEHI 231 and mouse splenic B cells following CD40 stimulation. Induction of these surface molecules and transcription factors was also seen in stable cell lines expressing p190RhoGEF and a constitutively active form of RhoA in the absence of CD40 activation. Moreover, the amounts of secreted IgM and IgG were high in these cells, but not in cells expressing a dominant negative form of p190RhoGEF or RhoA. Similar results were observed in transgenic mice carrying a wild type or a dominant negative form of p190RhoGEF. Serum levels of IgM and IgG were strongly increased in wild type transgenic mice after immunization with T-cell dependent antigen. In addition, a significant induction of pre-plasma memory B cell population (CD138-B220-) in the spleen of WT-Tg mice, as well as long-lived plasma cell population (CD138+B220-) in the bone marrow of these mice, was observed after secondary immunization. Collectively, these results suggest that p190RhoGEF may function though RhoA activation and CD40-induced expression of p190RhoGEF may play a role in the process of B cell differentiation to plasma cell.