대장암에서 5-fluorouracil 감수성의 지표로서 현미부수체 불안정성과 Dihydropyrimidine dehydrogenase 발현의 연관성에 대한 연구

Abstract

대장암의 치료는 수술뿐 아니라 병기에 따라 항암 화학요법이 반드시 필요한 것으로 알려져 있으나 항암제에 대한 반응률은 매우 낮고 같은 암종이라 하더라도 개개인에 따라 항암제에 대한 감수성은 많은 차이를 보인다. Dihydropyrimidine dehydrogenase(이하DPD)는 5-fluorouracil(이하 5-FU)의 분해과정에 가장 중요한 역할을 하는 효소로서 최근 연구들에서 암종 내의 DPD mRNA의 발현 정도가 항암제 감수성과 관련이 있다는 보고가 많다. 현미부수체 불안정성(Microsatellite instability,이하 MSI)은 대장암의 암화과정에 매우 중요한 인자로 인식되고 있으며, 최근 항암제 감수성과의 연관성이 제기되는 분자생물학적인 표지자이다. 본 연구는 대장암에서 대장 선암종 조직의 항암제 감수성과 연관이 있다고 알려진 DPD mRNA발현과 MSI와의 연관 관계를 알아보고자 하였다. 이화여자대학교 동대문 병원 외과에서 대장 선암종으로 진단받고 수술을 받은 환자 59예를 연구대상으로 하였다. DPD mRNA 발현 정도는 최근 개발되어 임상에 활발히 적용되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 방법으로 정량 측정하였다. DPD mRNA의 정량분석은 기준유전자(reference gene)인 G6PDH와 DPD cDNA를 함께 중합효소 연쇄반응하여, 중합효소 연쇄반응 과정의 형광의 변화를 상대적으로 계산하여 표준화비율(normalized ratio)로 표시하였다. MSI는 미국 국립 암 연구소에서 권장하는 5개의 현미부수체 표지자(microsatellite marker : BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, D17S250)를 중합효소 연쇄반응을 이용하여 확인하였다. 대상 환자의 평균연령은 59세(55.8 10.5: 범위 36-81세)였으며, 성별분포는 남자 35명, 여자 24명이었다. 선암종 분화도는 고분화 및 중등도 분화암이 55예(93.2%)였으며, 미분화암이 4예(6.8%)였다. 암종의 위치에 따라 비장만곡부위를 중심으로 근위부 암과 원위부 암으로 분류하였는데, 근위부 암이 10예(16.9%)였으며, 원위부 암이 49예(83.1%)였다. 병기별 분포는 Stage I 7명(11.9%), II 17명(28.8%), III 29명(49.2%), IV 6명(10.2%)이였다. DPD mRNA의 양은 0부터 67.3으로 평균값은 5.1±9.6이였고, 중간값은 2.5였다. DPD mRNA의 발현량은 환자의 연령, 성별, 암세포의 분화도, 암종의 위치와는 무관하였으며, 림프절 전이가 없는 군의 DPD mRNA 과발현군(66.7%)이 림프절 전이가 있는 군의 DPD mRNA 과발현군(40.0%)보다 통계적으로 유의하게 많았다(p=0.04). MSI의 빈도는 MSS 36예(83.7%), MSI-L 4예(9.3%), MSI-H 3예(7%)였다. MSS와 MSI-L를 현미부수체 안정군, MSI-H를 불안정군으로 구분해 분석한 결과 DPD mRNA의 발현과 MSI의 연관관계를 밝힐 수 없었다. 본 연구 결과 대장 선암종 조직에서 DPD mRNA 발현량은 임상 및 병리적 특성과 무관하게 다양하게 나타났으며 MSI와의 연관성을 밝힐 수 없었다. 따라서 5-FU에 대한 반응 정도와 관계가 있는 것으로 알려진 DPD mRNA와 MSI는 서로 다른 생물학적인 경로를 통하여 항암제 감수성에 영향을 주는 것으로 생각된다. 본 연구에서는 원위부 대장암의 빈도가 83.1%로 상대적으로 많으며 MSI는 원위부 대장암에서 발생 빈도가 매우 낮아 MSI의 단독측정만으로 5-FU 감수성을 예측할 수 없는 결과를 나타낸 것으로 생각되며 향후 근위부 대장암을 좀 더 많이 연구하여야 그 의의를 확인할 수 있을 것으로 생각된다. ;Patients with stage III colorectal cancer(CRC) are generally considered to benefit from adjuvant 5-flourouracil(5-FU) chemotherapy, which is often given in combination with leucovorin or levamisole. 5-FU has been used for more than 40 years for the treatment of various cancers and remains the standard first-line treatment for CRC, although the response rate as a single agent is usually in the 20 - 25% range and rarely exceeds 40%, even with biochemically modulated schedules. If patients with tumors sensitive to 5-FU are be identified before the initiation of therapy, 5-FU treatment could be targeted to this group. Such selection ability would spare toxicity for patients unlikely to respond and would allow faster progress in new drug development. Recently, increased understanding of the mechanism of action of 5-FU has led to the development of strategies that increase its anticancer activity and select the subgroup of patients tend to better respond to 5-FU. In vitro studies have also shown that the enzymatic activity of dihydropyrimidine dehydrogenase(DPD), a rate-limiting enzyme in 5-FU catabolism which converts 5-FU to dihydrofluorouracil, is related with 5-FU chemo-sensitivity. Microsatellite instability(MSI) is associated with defects in mismatch repair gene and is becoming a very important molecular maker to predict the prognosis of CRC. Moreover, recent non-randomized retrospective study has revealed that MSI is related with sensitivity of 5-FU based chemotherapy. This study aimed to determine whether DPD mRNA expression is related with MSI status of primary CRC by measuring the DPD mRNA expression and the MSI status in tumor tissures. Tumor samples and adjacent normal colonic mucosal tissues from fifty-nine patients who underwent operations between September 2001 and April 2003 from Department of Surgery, Ewha Womans University Hospital have been stored at tissue bank. DPD mRNA expression was determined by the real-time RT-PCR method and MSI status was determined by multiplex fluorescent PCR using 5 reference markers recommend by the National Cancer Institute. The results were compared with the clinico-pathologic variables to find any relations. Student T-test and chi-square test were performed to analyze the statistical significance. The mean age was 59 years(range 36-81) and female comprised 41 per cent(n=24). Fifty-five cases(93.2%) were histologically well or moderately differentiated. Forty-nine cases of tumors(83.1%) were located distal to splenic flexure. Forty-six patients(78%) were TNM stage II(n=17) or stage III(n=29). DPD mRNA expression level was informative in all 59 cases. The median expression level was 2.5(range:0-67.33). There was no correlation between the tumor DPD mRNA expression level and age, gender, tumor location, depth of tumor invasion or TNM stage. However, node negative tumors showed higher proportion of over-expression of DPD mRNA(66.7%) compared with that of node positive tumors(40.0%)(p=0.04). MSI status was informative in 43 cases(72.9%). Thirty-six cases(83.7%) were microsatellite-stable(MSS). Four cases(9.3%) showed low-level microsatellite instability (MSI-L) and 3 cases(7.0%) showed high-level microsatellite instability(MSI-H). There was no correlation between the MSI status and age, gender, depth of tumor invasion, nodal status or TNM stage. Proximal located tumors showed higher proportion of high level microsatellite instability compare with that of distal located tumors(25% vs. 2.9%, p=0.03). There was no correlation between tumor DPD mRNA expression level and MSI status(r=0.29, p=0.09). The expression level of tumor DPD mRNA was variable among tumors. The low frequency of MSI tumors in distal located tumors prohibits the use of the MSI status as a predictor of 5-FU chemo-sensitivity. In conclusion, the role of the tumor DPD mRNA expression and MSI status as the predictive markers of response to 5-FU chemotherapy remain to be confirmed in a more large-scale study.