Neuroprotective effects of wogonin produced by the inhibition of microglia activation

Abstract

Flavonoids comprise a group of low molecular weight, naturally occurring plant products. They conduct a variety of biological activities such as anti-inflammatory, antioxidant, antiviral, antitumor and antiallergic actions. Wogonin (5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone) is a flavonoid from the root of Scutellaria baicalensis Georgi, has antioxidant and anti-inflammatory properties. Thus, wogonin has been widely used in clinical treatment of inflammatory diseases, including atopic dermatitis, hyperlipemia, and atherosclerosis. Microglia, the brain resident macrophages, play an active role in brain inflammatory, immune and degenerative processes. Many of the effects of activated microglia are mediated by their numerous secreted products, among which are nitric oxide (NO), inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6), chemokines such as monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and regulated upon activation normal T cell expressed and secreted (RANTES), and anti-inflammatory cytokines such as transforming growth factor-beta1 (TGF-β1). Detection of proinflammatory cytokines in brain macrophage/microglia-like cells after viral infection and in demyelinating regions is a measure of inflammatory response in nervous system. In this study, I investigated the effect of wogonin on in vivo and vitro models; global and focal cerebral ischemia models, lipopolisaccharade (LPS)-induced microglia activation, chemotaxis assay and phagocytosis. In the global ischemia model, wogonin conferred neuroprotection by markedly reducing the number of damaged pyramidal cells in the CA1 subfield. In the focal ischemia model, it also reduced the brain infarct volume. Potential anti-inflammatory activity of wogonin in brain microglia was tested by evaluating the production of inflammatory mediators from cultured microglia. When primary microglia were stimulated with LPS, microglia in a dose- and a time-dependently increase the production of NO, TNF-α, IL-6 and chemokines such as MCP-1 and RANTES. Wogonin inhibited the production of NO in a dose-dependent manner. Wogonin reduced mRNA levels of iNOS, TNF-α and IL-6 in BV2 cells stimulated by LPS. Wogonin significantly inhibited the production of TNF-α, IL-6 and chemokines such as MCP-1 and RANTES. Furthermore, wogonin significantly reduced the NF-kB activity but not MAPK activity. Migration is an important process involved in development, wound healing, and tumor metastasis in CNS. During activation in response to injury and inflammation, microglia can actively migrate into the damaged region in the brain, where they release proinflammatory cytokines and cytotoxic agents. Thus, as the initial step, microglia migration plays crucial role in the propagation of the neuroinflammatory response. I determined that wogonin reduced the migration stimulated by the chemokines. Phagocytosis is another important parameter to define the activation state of microglia. During brain remodeling and maturation, microglia is believed to assist in the clearance of cells elimination through programmed cell death. They play an important role in the establishment and maintenance of brain damage when the magnitude of the microglia reaction surpasses a critical threshold level. When CNS insults, microglia migrate to areas of tissue injury and eventually engage in phagocytosis, where they release proinflammatory cytokines and cytotoxic agents. Wogonin significantly reduced TNF-α production, but did not modulate the phagocytotic activity of microglia. Taken together, these results support that wogonin suppresses the release of cytokines related to inflammation of microglia, along with the mechanism of the inhibition of NF-kB transcriptional activity. Wogonin may be therapeutically useful for the treatment of inflammation-associated CNS diseases such as cerebral ischemic stroke.;플라본류(Flavonoids)는 저분자량으로 구성된 천연 식물로서 갖가지 생물학적 작용이 있는데 례를 들면 항염증, 항산화, 항바이러스, 항암작용과 항알레르기 등 작용이 있다. 우고닌 (wogonin) (5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone)은 플라본류의 일종으로서 한약재인 황금(黃芩)으로부터의 추출물이다. 우고닌은 항산화작용과 항염증작용이 있는것으로 밝혀졌고 임상에서 아토피성 피부염, 고지방혈증 과 동맥경화를 비롯하여 많은 염증성 질병에 사용되고있다. 소교세포는 뇌에 존재하는 면역세포로서 뇌에 염증성, 면역성과 퇴행성 질환 등 손상을 받았을 때 중요한 역할을 한다. 활성화된 소교세포는 자기자체로부터 분비되는 다양한 물질들에 의해 작용을 하는데 그들의 분비물로는 주로 친염증성 사이토카인들 (TNF-a, IL-6, NO, chemokine등) 과 항염증성 사이토카인 (TGF-b1 등) 이 있다. 대뇌에 감염이나 외부적 손상으로 말이집탈락 (demyelinating) 되었을 때 그 부위에 친염증성 사이토카인들이 생성되는데, 이때 친염증성 사이토카인의 생성정도를 측정하는 것은 신경계의 신경염증반응을 측정하는 지표로 사용 가능하다. 본 연구에서는 다양한 동물실험과 세포실험 모델에서 우고닌이 어떤 작용을 하는지 대해서 실험을 진행하였다. MCAO 및 4-vessel occlusion 을 사용한 허혈성 뇌졸중 모델에서 우고닌은 신경세포의 보호작용을 보였다. 우고닌의 항염증작용 테스트를 위하여 먼저 1차 배양 소교세포에서 LPS를 주고 활성화된 소교세포로부터 생성되는 염증성 매자를 측정하였다. LPS 로 인해 활성화된 소교세포는 염증성 매자인 NO, TNF-a, IL-6, MCP-1, RANTES 를 농도와 시간에 비례하게 생성한다. 우고닌은 이들의 mRNA 발현과 단백질 생성을 현저하게 억제하였다. 이러한 작용들은 NF-kB 활성을 억제를 수반하였으나 MAPK 활성과는 상관이 없었다. 소교세포의 이동현상은 중추 신경계의 발달과 상처의 치료, 그리고 암세포의 전이 등에서 중요한 역할을 한다. 뇌에 외부적 손상이나 염증이 생겼을 때 소교세포는 손상부위로 이동해서 그곳에서 활성화되면서 친염증성 사이토카인들을 분비함으로 해서 신경세포에 독성을 유발한다. 본 실험에서 우고닌은 MCP-1 에 의한 소교세포의 이동현상을 현저하게 억제하였다. 식작용은 활성화된 소교세포의 또 다른 중요한 특징이다. 소교세포의 식작용은 주추신경계의 성숙과 재형성에 중요한 역할을 한다. 뇌조직에 신경세포사멸이나 외부적침입에 의해 손상을 입었을 때 소교세포는 사멸된 세포나 외부 침입자를 식작용을 통해 제거하는데 이 과정에서 소교세포는 활성화되고 친염증성 사이토카인을 분비한다. 본 실험에서 우고닌은 소교세포의 식작용에는 영향을 주지않았지만 식작용에 의해 분비하는 TNF-a 의 분비는 억제하였다. 이러한 실험결과에서 우고닌은 뇌신경보호작용과 항염증 작용을 갖기 때문에 신경염증을 수반하는 뇌질환의 치료에 우고닌을 사용할 수 있는 가능성을 시사한다.