비소세포 폐암에서 유전자 발현 지문과 전산화 단층 촬영의 조합을 통한 림프절 전이의 진단

Abstract

비소세포 폐암은 세계적으로 남녀 모두에게 주된 암 사망의 원인이 되며 최선의 치료 방법은 조기 발견과 근치적 절제술이다. 그러나, 수술 전 종격동 림프절 전이가 있는 경우 수술 후 장기 생존의 가능성은 매우 적으므로 일차적 치료 방침과 예후를 판단하는데 있어서 수술 전 림프절 전이 여부를 정확하게 진단하는 것은 중요하다. 현재까지 림프절 전이의 진단을 위해 사용되고 있는 영상 의학적 또는 침습적 방법은 그 정확성에 있어서 만족스럽지 못하거나 시술에 따른 위험성을 가지고 있다는 단점이 있다. 최근 형태학적 진단의 단점을 보완하고자 생물학적 진단 방법을 사용하고 있으나, 기존의 면역 화학적 방법은 제한된 수의 표지자의 발현을 관찰하는데 시간과 노력이 많이 든다는 단점이 있어 광범위한 유전자 발현을 관찰 할 수 있는 microarray 방법을 사용하여 유전자 발현 양상을 가지고 림프절 전이를 예측할 수 있는지 연구하고, 전산화 단층 촬영과 유전자 발현 결과를 조합하였을 때 어떠한 진단적 의미를 가지는지 알아보고자 한다. 비소세포 폐암으로 폐절제술과 림프절 곽청술을 받은 환자 104명을 대상으로 하였다. 절제한 폐암 종괴의 변연부에서 채취한 암 조직의 일부를 신선 동결 한 다음 미세 절제(microdissection)하여 얻은 조직편에서 mRNA를 추출하고 역전사(reverse transcription)하였다. cDNA를 증폭하여 표지하고, 올리고핵산 microarray에 부합법을 실시한 다음 형광 발색 정도에 따른 mRNA 발현 양상을 분석하였다. 적출된 림프절과 폐암 조직은 병리 전문의가 관찰 하고 병기를 결정하였다. 61명(59%)에서 림프절 전이가 없었으며(pN0) 43명(41%)에서 림프절 전이를 보였는데, 이들 중 20명은 국소 림프절 전이를(pN1), 23명(22%)은 종격동 림프절 전이(pN2)를 나타내었다. 1차적으로 선별된 2,565개의 유전자에 대하여 hierarchical clustering을 시행하여 세 개의 cluster로 구분 하였다(cluster I: 90%에서 pN0, cluster II: 83%에서 pN1 또는 pN2, cluster III: 66%에서 pN0, p<0.01). 2,565개의 유전자 중 림프절 전이를 예측하는데 의미 있는 유전자 218개를 선택하였고(permutation test, p<0.0001), 이 218개의 유전자 중에서 무작위로 선발된 2개의 유전자 BCL-3와 granzyme A에 대하여 실시간 정량 중합 효소 연쇄 반응을 시행하였을 때 microarray 에서 나타난 발현 양상과 높은 상관 관계를 나타내었다(correlation coefficient 0.7993, p=0.0006 / 0.9705, p<0.001). 선별된 218개의 유전자의 림프절 전이 예측의 정확도를 보고자 교차 검증을 시행하였을 때 정확성은 80%였고, 각 병기 별로 세분하여 교차 검증을 실시하면 병기 별 예측의 정확도는 I기, II 기, III기에서 각각 98%, 61%, 71% 였다. Microarray 결과를 바탕으로 림프절 전이 가능성이 높은 고 위험 군 53명과 저 위험 군 51명으로 구분할 수 있었고(Cox proportional hazard regression modeling, p<0.01), 이 때 위험 군 분류와 전산화 단층 촬영에 나타난 림프절 전이 유무를 조합하여 병리 검사 결과와 비교하였을 때, 위험 군 분류와 전산화 단층 촬영 결과가 같은 경향을 보이는 환자 66명 중 59명(89%)에서 병리 검사 결과와 일치하였다. 결론으로 비소세포 폐암 환자에서 림프절 전이를 예측하는데 있어서 microarray를 이용한 유전자 발현 지문 양상의 분석 방법은 높은 정확도를 나타내었으며, 흉부 전산화 단층 촬영의 결과와 유전자 발현 지문을 조합하였을 때 전산화 단층 촬영 만으로 림프절 전이를 진단하는 것 보다 정확성을 높이고 종격동경 하 생검과 같은 침습적 검사를 피할 수 있는 유용한 진단 도구로 사용 될 수 있을 것이다. ;Non-small cell lung cancer is a main cause of cancer-related death both men and women. Although the best treatment is early diagnosis and curative resection, pathologically confirmed mediastinal lymph node metastasis decreases the chance of long-term survival even after curative resection. Therefore accurate diagnosis of lymph node metastasis is crucial to determine primary modality of treatment and prognosis. Imaging studies for lymph node metastasis have not been satisfactory in accuracy and invasive techniques could involve serious complications. Although biologic diagnostic methods such as immunohistochemistry or in situ hybridization may have roles complementary to morphologic ones, these methods are laborious and time-consuming. On the contrary, microarray is large-scale gene expression survey method that overcomes weak points of conventional biological methods. The aim of this study is to analyze whether mRNA expression profile using microarray predict lymph node metastasis with acceptable accuracy and whether the combination of the chest CT with the risk group analysis based on gene expression profile can have significant role in diagnosis of lymph node metastasis. One hundred four patients who had undergone lung resection and systemic lymph node dissection for non-small cell lung cancer were included. Tissue specimens from periphery of cancer mass were frozen and microdissection of snap-frozen tissue section was done. After mRNA extraction, reverse transcription and cDNA amplification by polymerase chain reaction was performed. Fluorescent-labeled cRNA was hybridized to oligonucleotide microarray chip. mRNA expression profiles were analyzed based on fluorescence intensity. Pathologic stages were determined. Sixty-one patients did not have lymph node metastasis (pN0). 20 patients had regional lymph node metastasis (pN1), and 23 patients had mediastinal lymph node metastasis (pN2). Hierarchical clustering was performed for 2,565 genes selected via preliminary filtering. Three clusters were identified. Cluster I and III mainly included pN0 (90% and 66%, respectively). Cluster II included pN1 or pN2 (81%). 218 genes which were significant in prediction of lymph node metastasis were selected (permutation test, p<0.0001). RTQ-PCR was done for randomly selected two genes (BCL-3, granzyme A) among 218 genes to validate microarray data. Expression of mRNA on RTQ-PCR was highly correlated with expression on microarray (correlation coefficient 0.7993, p=0.0006 / 0.9705, p<0.001). Accuracy of 218 genes for prediction of lymph node metastasis was 80% by cross-validation. Accuracy according to stage was 98% for stage I, 61% for stage II, and 71% for stage III. High-risk group (n=53) and low-risk group (n=51) for lymph node metastasis were classified based on microarray (Cox proportional hazard modeling, p<0.01). When the combination of the results of lymph node metastasis on chest CT with results of risk group analysis was considered, sixty-six patients (89%) showing same trend on both CT and microarray (metastasis on CT-high risk or no metastasis on CT-low risk) had consistent results on pathology. In conclusion, mRNA expression profile using microarray showed high accuracy in prediction of lymph node metastasis in non-small cell lung cancer. The combination of chest CT with microarray may improve the diagnostic accuracy of chest CT to reserve the invasive diagnostic techniques.