만성 부동스트레스 및 LPS에 의한 망막의 세포화학적 변화

Abstract

Stress is the non-specific response to adjust the balance of body function following danger, challenge, continuous stimulus. In this experiment, the immobilization stress using plastic rodent restrainer among the several stressor used to animal model to investigate the cytochemical changes in the retinal cells. After chronic stress, biological changes of retinae were demonstrated by western blot and immunohistochemistry. Also, modulation of physiological reaction by stress was examined in terms of changes of sphingolipid metabolite in serum, and changes of immunoreactions of retinae after continuous infusion of sphingolipid into cerebroventricle. To investigate the stress-induced cytochemical changes in retinae, rats (4-5 month old) were given immobilization stress for 6 hr/day to 3 weeks. There was no significant changes of immunoreactivities in the expression of glial fibrilary acidic protein (GFAP), vimentin, nNOS and NMDAR1 in retinae of stressed rats. To investigate the more selective regional changes in stress-given retina, retina tissues were sectioned and immunocytochemical changes were examined by using GFAP and vimentin antibodies. As a result, GFAP and vimentin expression from nerve fiber layer to ganglion cell layer in retinae of chronic stress-given group. However, there was no significant increase of OX-42 and iNOS expression in chronic immobilization stress. To find out the changes of sphingolipid metabolite in serum of stress-induced rats, the level of sphingosine-1-phosphate (So-1-P) was elevated in immobilization stress. To further investigate the effect of increased So-1-P in immobilization stress, So-1-P was infused into intracerebroventricle (i.c.v.) of rats by using osmotic minipump with the flow rate of 100 pmol/10㎕/hr for 7 days. As a result, the expression of GFAP was increased in the retina of So-1-P-infused rats as a similar pattern like chronic immobilization stree. The expression of STAT1 or STAT3 was not changed by the chronic stress, however, the expression of STAT3 and pSTAT3 was increased by intraperotoneal administration of LPS. Interestingly, around 120 genes among 12,000 genes in mice retinae were modulated after chronic immobilization stress in microarray by using oligochip analysis. The six crystallin genes, a kind of small heat shock protein, were down-regulated after chronic stress. In conclusion, immobilization stress increased the expression of reactive gliosis marker such as GFAP and vimentin in retinae. Also, sphingolipid metabolism might be involved in immobilization stress since the level of So-1-P was increased in blood after immobilization. In addition, the infusion of So-1-P into intracerebroventricle elevated the expression of GFAP and vimentin in retinae. These results suggest that stress affects the generation of sphingosine-1-phosphate and induces the activation of astrocytes in the retinae. ;본 연구에서는 만성 스트레스 유발 시 흰쥐의 망막세포에서 일어나는 세포화학적 변화를 조사하기 위해서 여러 가지 스트레스인자(stressor) 중 plastic rodent restrainer를 사용한 부동 스트레스(immobilization stress)로 동물 모델을 만들었다. 만성 스트레스 유도 후 망막세포에서 일어나는 변화를 생물화학적방법 및 면역조직화학염색법으로 확인하였고 또한 스트레스로 인해 일어난 생리반응 변화를 혈청 내 이차전달 물질로 밝혀진 스핑고지질을 측정하고 이의 망막에 대한 작용가능성을 규명하기 위해 뇌실로 투여한 후 망막의 세포화학적 변화를 측정하였다. 또한 스트레스시 pro- inflammatory cytokine에 의해 여러 병변이 발생할 수 있다는 가능성에 대하여 lipopolysaccharide(LPS)를 동물에 복강 및 뇌실 투여한 후 망막의 변화를 스트레스 처치군과 비교 분석하였다. 만성 스트레스 유도로 인한 망막의 세포화학적 변화를 알아보기 위해 4-5 개월 된 흰쥐에 부동 스트레스를 하루에 6시간씩 3주간 유도하였다. 망막세포를 분리하여 western blot을 이용한 분석에서 스트레스군에서 아교세포 표지자인 glial fibriliary acidic protein(GFAP)와 vimentin 그리고 neuronal nitric oxide synthase(nNOS), 및 NMDAR1의 유의적 변화는 볼 수 없었다. 망막세포의 부위별 미세변화를 측정하기 위하여 망막을 분리하고 동결절편화 한 후 항체를 이용하여 면역조직화학염색법으로 확인한 결과, 대조군에 비해 스트레스를 받은 군에서는 GFAP와 vimentin의 면역반응성이 신경섬유층(nerve fiber layer)-신경절세포층(ganglion cell layer)에서 특히 증가함을 보였다. 그러나 소교세포의 활성지표인 OX-42와 iNOS의 면역반응은 대조군과 큰 차이가 없었다. LPS를 뇌실로 직접 1주일간 투여한 망막에서도 면역반응의 변화는 없었다. 스트레스 중 변화되는 스핑고지질계열의 biomarker를 탐색하던 중 혈액 내 혈청을 분석한 결과 부동 스트레스에서 sphingosine-1-phosphate (So-1-P)가 유의적으로 증가하였다. 부동 스트레스 시 증가한 So-1-P가 망막에 미치는 영향을 알아보기 위해 흰쥐의 뇌실에 So-1-P를 osmotic minipump를 이용하여 1주일간 주입(100pmol/㎕/hr)한 결과 대조군에 비해 GFAP의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 한편 망막세포에서 cytokine의 수용체매개 신호전달계인 STAT의 변화를 western blot법으로 분석한 결과 만성 스트레스군에서 STAT1과 STAT3, pSTAT3의 변화가 없었으나 LPS 처치군은 STAT3 및 pSTAT3의 발현이 증가하였다. 스트레스시 망막세포의 유전자변화를 microarray를 이용하여 측정한 결과 만성스트레스시 120여종의 유전자발현이 변화되었고 특히 세포병변을 억제하는 small heat shock protein인 crystallin의 발현이 억제됨을 알 수 있었다. 결론적으로 대조군에 비해 스트레스 처치군의 망막 신경섬유층-신경절세포층에서 교세포의 지표로 알려진 GFAP와 vimentin의 면역반응이 증가되어 만성 스트레스시 망막의 변성이 유도됨을 입증하였다. 스트레스시 혈액에서 So-1-P가 증가되고 뇌실로 So-1-P을 투여한 결과 망막에서 GFAP의 발현이 증가됨을 알 수 있어 스트레스시 증가되는 So-1-P가 망막의 교세포를 활성화 시켜 망막변성을 초래할 가능성이 있음을 시사해 주었다.