Effects of histone deacetylation on CYP3A4 proximal promoter activity in hepatic cells

Abstract

Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) is the most abundant CYPs in human liver, comprising approximately 30% of the total liver CYPs contents and is involved in the metabolism of more than 60% of currently used therapeutic drugs. The expression of CYP3A4 is induced by a variety of structurally unrelated xenobiotics including the antibiotic rifampicin and endogenous hormones, and might be mediated through steroid and xenobiotic receptor (SXR) system. The molecular mechanisms underlying regulation of CYP3A4 gene expression have not been understood. In order to gain the insight of the molecular mechanism of CYP3A4 gene expression, study has been undertaken to investigate if the histone deacetylation is involved in the regulation of CYP3A4 gene expression by proximal promoter or not. Also SXR and estrogen receptor (ER) were investigated to see if they were involved in the regulation of CYP3A4 proximal promoter activity. HepG2 or Hepa-I cells were transfected with a plasmid containing ∼1kb of the CYP3A4 proximal promoter region (-863 to +64 bp) cloned in front of a reporter gene, luciferase, in the presence or absence of SXR or hERα. Transfected cells were treated with CYP3A4 inducers such as rifampicin, PCN and RU 486, or with estradiol, in order to examine the regulation of CYP3A4 gene expression in the presence or absence of trichostatin A (TSA). In HepG2 cells, CYP3A4 inducers and estradiol increased significantly the luciferase activity by CYP3A4 proximal promoter, only when TSA was co-treated after SXR cotransfection. Estradiol, however, also increased the luciferase activity significantly when hERα was cotransfected, regardless of TSA. In the case of Hepa-I cells, CYP3A4 inducers and estradiol increased modestly the luciferase activity when TSA was co-treated, but this increment was not enhanced by SXR cotransfection in contrast to HepG2 cells. In addition, estradiol increased the activity significantly when TSA was co-treated after hERα cotransfection in Hepa-I cells. Taken together, these results indicated that the inhibition of histone deacetylation was required to SXR-mediated increase in CYP3A4 proximal promoter region when rifampicin, PCN or estradiol was treated. Estradiol increased CYP3A4 through hERα as well as SXR in the presence of TSA. Further a trans-activation by SXR may demand other species-specific transcription factors.;CYP3A4는 사람의 간에서 가장 많이 존재하는 약물대사효소로서, 간 내 Cytochrome P450s 총량의 약 30%를 차지하며, 현재 시판되고 있는 약물 중 약 60% 이상의 인체 내 대사과정에 관여한다. CYP3A4의 유전자 발현은 항생제인 rifampicin을 비롯하여 구조적으로 서로 관련이 없는 다양한 외인성 물질 및 내인성 물질에 의하여 유도되며, 이러한 유도작용에 steroid and xenobiotic receptor (SXR)이 관여할 것으로 알려져 있다. CYP3A4의 유전자 상의 cis-element인 ER-6나 DR-3만으로 SXR에 의한 CYP3A4 유도반응이 야기될 수 있으며, enhancer인 xenobiotic responsive enhancer module (XREM)이 존재하는 경우 rifampicin에 의한 유도반응이 현격히 증가한다. 그러나 CYP3A4의 proximal promoter가 단독으로 CYP3A4 유도반응을 조절하는지에 대한 연구결과는 아직까지 많이 보고되어 있지 않다. 따라서 본 논문에서는 CYP3A4 proximal promoter의 유전자 발현 조절작용에서 histone deacetylation, SXR 및 human estrogen receptor alpha (hERα)의 개연성에 대하여 연구하였다. CYP3A4 proximal promoter region (-863 ~ +64 bp)을 reporter 유전자인 luciferase에 클로닝한 플라스미드 (phCYP3A4-Luc)를 제작하여, HepG2 세포 또는 Hepa-I 세포에 도입 발현시켰다. 이때 플라스미드를 도입한 세포에 SXR을 동시에 도입하여, CYP3A4 유도제인 rifampicin, Pregnenolone 16α-carbonitrile (PCN), RU486 또는 내인성 물질인 estradiol을 24시간 동안 처리하고 reporter 단백질인 luciferase 효소활성을 측정한 결과, 이들 화학물질에 의한 luciferase 활성 증가는 관찰되지 않았다. HepG2 세포에 phCYP3A4-Luc과 SXR을 함께 도입하고 trichostatin A (TSA)를 위의 화학물질 들과 병용 처치한 경우, CYP3A4 유도제와 estradiol이 luciferase 발현을 유의적으로 증가시켰다. 그러나 HepG2 세포에 phCYP3A4-Luc과 hERα를 함께 도입한 경우에는 TSA 처치와 상관없이 estradiol이 promoter activity를 유의적으로 증가시켰다. Hepa-I 세포의 경우, TSA를 CYP3A4 유도제인 rifampicin, PCN 또는 내인성 물질인 estradiol과 병용 처치했을 때 CYP3A4 유도제와 estradiol이 효소활성을 유의적으로 증가시켰으며, 이러한 유도반응은 HepG2 세포와 달리 SXR의 동시 도입에 의하여 영향을 받지 않았다. 또한 phCYP3A4-Luc과 hERα를 함께 Hepa-I 세포에 도입하고 TSA를 estradiol과 병용 처치 하였을 때, 유도반응이 유의적으로 증가되었다. 이상의 연구결과로부터 rifampicin, PCN, estradiol은 CYP3A4 proximal promoter 부위에서 SXR을 매개하여 CYP3A4 유전자 발현을 증가시킬 수 있으며, 이 과정에는 histone deacetylase 저해에 의한 chromatin structure remodeling이 필요함을 알 수 있었다. 또한 estradiol은 TSA와 병용 처치하였을 때 SXR 뿐만 아니라 hERα에 의해서도 CYP3A4 유전자 발현 증가작용이 매개됨을 확인하였으며, SXR에 의한 유전자 발현 활성화 과정에는 종 특이적 전사요소가 관여할 것으로 사료된다.