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Identification of a Mature form and Characterization of Thermostability of a Serine-type Protease from Aquifex Pyrophilus

Title
Identification of a Mature form and Characterization of Thermostability of a Serine-type Protease from Aquifex Pyrophilus
Authors
김윤경
Issue Date
2001
Department/Major
대학원 화학과
Keywords
Aquifex Pyrophilus분해효소효소활성화
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
Aquifexpyrophilus, a hyperthermophilic bacterium, has a serine-type protease that located at the cell wall fraction with a mature size of 43kDa. Molecular cloning of the protease gene revealed that it has an ORF of 619 amino acids with homologous catalytic site of serine-type proteases [Choi, I.-G., Bang, W.-K., Kim, S.-H., Yu, G. Y., J. Biol. Chem. (1999), Vol. 274, pp881-888]. Several mutants containing different regions of the protease gene including alanine-substituted mutant at the active site serine were constructed, and the factors that affecting the expression level of the cloned protease gene in E. coli have been examined. The presence of C-terminus hydrophobic region of the protease hindered over- expression in E. coli. Also, the proteolytic activity of the expressed protein appeared to be toxic to E. coli. An inactive form that deleted both of the N- terminal signal sequence and C-terminal nonpolar residues was over-expressed in a soluble form, purified to homogeneity, and examined its thermostability. The purified protein showed three disulfide bonds and three free sulfhydryl groups. The thermal denaturation temperature of the protein was measured around 90 ℃ using differential scanning calorimeter and circular dichroism spectrometry. The disulfide bonds were hardly reduced in the presence of reducing agents suggesting that these disulfide bonds located inside of protein surface. By performing partial digest with protease, we expected the processing region of mature form.;초고온성 세균인 Aquifex pyrophilus는 선구체로부터 공정된 형태인 43kDa의 Serine형 단백질 분해효소를 세포 벽에 위치한 상태로 지니고 있다. 619개의 아미노산 서열을 갖는 이 단백질 분해효소의 분자 생물학적인 연구에서는 이것이 Serine형 단백질 분해효소의 효소 활성화 자리와 유사성이 있음을 보여준다 [Choi, I.-G. Bang, W.-K., Kim, S.-H., Yu, G. Y., J. Biol. Chem. (1999), Vol. 274, pp881-888]. 효소 활성화 자리의 Serine이 Alanine으로 치환된 돌연변이체를 포함한, 단백질 분해효소 유전자의 서로 다른 부분을 포함한 돌연변이체를 만들어 이것이 E.coli메서 단백질의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. C말단의 소수성 부분이 E.coli메서 단백질의 발현을 저해하는 역할을 하였고 또 단백질 분해효소의 효소활성화 성질이 E.coli에 유독한 영향을 주어 단백질의 발현에 영향을 주었다. N말단의 Signal sequence와 C말단의 비극성 잔기를 제거한 비활성 돌연변이체에서는 단백질이 가용성 형태로 대량 발현되었다. 이 논문에서는 이 단백질을 정제하고 그것의 열적 안정성에 대해 연구하였다. 정제된 단백질은 3개의 이황화 결합과 3개의 자유로운 황화 수소기를 가지고 있었다. 분별 주사 열량계 (DSC)와 원편광 이색성 분광계 (CD Spectrophotometer)를 이용하여 측정한 단백질의 열적 변형 온도는 90℃이다. 환원제를 사용한 이황화 결합의 환원반응은 거의 진행되지 않았다. 이는 이들 이황화 결합들이 단백질의 표면으로부터 안쪽에 위치함을 보여준다. 이 단백질을 다른 단백질 분해효소를 이용해 부분적으로 분해 시킴으로써 선구체로부터 공정 되어지는 부분을 예측할 수 있었다.
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일반대학원 > 화학·나노과학과 > Theses_Master
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