Transcriptome Analysis of Cold Stress Response in Arabidopsis

Abstract

Many plants increase freezing tolerance in response to low, nonfreezing temperature through a phenomenon known as cold acclimation. This adaptive process involves several biochemical and physiological changes that seem to be regulated through changes in gene expression. As a first step to understand the molecular background of early responses to cold temperature in Arabidopsis leaf, the genome-wide gene expression profiles were characterized using the Long Serial Analysis of Gene Expression (LongSAGE). A total of 27,612 tags including 11,089 unique tags were sequenced and analyzed. Functional classification of the expressed genes in early cold response indicated that genes involved in light reaction of photosynthesis, prevalent in non-treated leaves, were expressed at a relatively low level. On the other hand, genes involved in photosynthetic electron transport and ATP synthesis were increased. A comparison of tags derived from the cold-treated leaves with those identified in the normal leaves revealed 315 differentially expressed genes (p <0.01). Genes including in cell wall modification, amino acid transport, signaling by calcium and kinase, stress response, hormone metabolism, lipid metabolism, mitochondrial electron transport, and amino acid metabolism were up-regulated. In contrast, genes involved in the synthesis of protein and RNA and especially in light reaction of photosynthesis were down-regulated. Also, the intensive comprehension of early cold response to cold was feasible through the comparative analysis with previously constructed SAGE libraries. Diverse strategies of protecting plants exposed to cold stress appeare to operate from the early stage. Signal transduction through the calcium mediated signal sensing, cascades of several kinases and transcription factors were distinguished in early cold response. Osmolytes, antioxidant and ROS scavengers provide the primary protection in early cold response. The repression of transport related genes was considered as the results from cold shock response, however, the repression of PSII genes in light harvesting system may play a role in protecting the photosynthetic system. Synthesis of salicylic acid (SA), nitrate assimilation, ammonia assimilation, gluconeogenesis pathway and glucosinolate biosynthesis were new information, never has been reported in relationship with cold stress. To understand the molecular outline of cold acclimation, deacclimation and reacclimation, 1.4 K cDNA microarray, “Coldstresschip”, fabricated in this laboratory by selecting differentially expressed genes from the cold-treated leaf and pollen was utilized. Based on the visual inspection of clustered data, distinct gene expression signatures in early-, transitory- and late- responses were exhibited. The signal flow of early- and late- cold responses in microarray system was coincident with that obtained from SAGE data analysis. Based on the comprehension of cold acclimation, the general changes of transcripts in deacclimation and reacclimation were analyzed. By applying the GSEA method with co-expressed gene sets, genome-wide identification of periodically expressed gene sets synchronized to cold response was performed. A contrary aspect to the pattern of gene expression emerged when acclimation and deacclimation was compared. Among genes displaying these characteristics, the roles of photosynthesis including chlorophyll binding, electron carrier activity and xanthrophyll binding were reinforced in deacclimation. On the contrary, the roles of calcium ion binding, kinase activity and transcription factor in deacclimation were attenuated compared with those of non-treated. The intensifying a role in light reaction of photosynthesis during cold deacclimation was reflected on the changes in transcripts during reacclimation. Gene sets including well known inducers of cold hardiness were reduced in reacclimation compared to the first cold acclimation. To reveal the architecture of underlying gene regulatory network and construct the gene sets for cold acclimation pathway, perturbed gene-expression profiles of the 47 Arabidopsis knockout mutants were examined using 1.4 K Coldstresschip. The gene regulatory network of early cold stress response (consisting of 181 genes and 325 interactions) was inferred in conjunction with CLR algorithm, and the 60 gene sets composed of regulator-regulon pairs were generated. Although Arabidopsis and Brassica belong to the same family Cruciferae, they differ in their ability to withstand cold stress. In an attempt to understand the molecular basis of such differences, comparative transcriptome analysis in response to cold stress was performed in (i) Arabidopsis esk1 mutants and Cvi ecotype, (ii) economic plants of 2 Chinese cabbage, 2 white cabbage and 2 broccoli belonging to the family Cruciferae, and (iii) a common cucumber of Cucurbitacea using Arabidopsis Coldstresschip. To diagnose cold response through GSEA method and find the gene sets contributing to cold resistance in cold-sensitive plants, network gene sets of early cold response and co-expressed gene sets were used to understand the cold response on global scale. As a result of diagnosis, the network gene sets contributing to the differential sensitivity were varied according to individual differences of plants. This means that the different strategies of adaptation against cold stress are adopted by each plant. Nevertheless, three network gene sets including the regulator of ZAT10, nucleolin and serine/threonine protein kinase showed the inclination of high expression in cold-tolerant plants compared with sensitive plants. This suggested that ABA-independent pathway seemed to play a major role on enhancing cold tolerance. The roles of photosystem II reaction center protein and protein synthesis in co-expressed gene sets were strengthened in Arabidopsis compared with other economic plants. These functions also seem to contribute to the enhancement of cold tolerance. These results suggest that the sum effects of several gene sets seem to determine the extent of the cold tolerance. The results in this study will provide valuable information of the regulatory network in early cold response to cold stress and contribute to produce freezing tolerant plants using signaling factors.;식물은 이동성의 결여로 인해 환경 적응 방법이 다른 생물 종보다 더 정교하게 발전되어 있다. 다양한 환경 조건 중에서 특별히 저온 스트레스는 식물의 생장 및 생식에결정적 요인으로 작용하므로 식물은 진화를 통해 이를 극복하거나 적응하는 형태, 생리, 생화학적 메커니즘을 발전시켜 왔다. 많은 식물체는 결빙 온도가 아닌 저온에 노출되었을 때 저온 순화(cold acclimation)라는 과정을 통하여 적응 능력을 증가시킨다. 이 과정에서 동반되는 많은 생리, 생화학적인 변화는 유전자 발현의 조절을 통하여 이루어 진다. 본 연구에서는 저온 스트레스의 인식 과정에서부터 실제 식물의 저온 내성에 기여하는 준비 단계까지의 복잡한 신호 전달 과정 중에서 주로 상위 단계에서 유전자의 발현 변화에 초점을 맞추어서 다음과 같은 연구를 진행하였다. 첫째, 초기 저온 반응을 이해하고, 초기와 후기에서 신호의 흐름을 구성하는 분자의 기능과 전달 경로 중심으로 저온 반응을 파악하였다. 둘째, 저온 순화 과정에서 신호 흐름을 기초로 하여 회복(deacclimation)과 재순화(reacclimation) 과정에서 유전자 조절 관계를 이해하고자 하였다. 셋째, 애기장대의 저온 순화 과정의 이해를 바탕으로 구축된 초기 저온 반응 네트워크를 이해하고, 이를 이용하여 저온에 대해 차별적 민감성을 보이는 식물의 저온 반응을 진단함으로써 유전자 발현 수준에서 차별성의 원인으로 추정되는 유전자 세트(gene set)를 발굴하였다. 애기장대 잎에서 저온에 대한 초기 반응의 분자적 배경을 이해하는 첫 단계로 유전체 수준의 정보를 주는 LongSAGE 방법을 도입하여 초기 저온 반응에서의 전사체(transcriptome) 정보를 확보하였다. 1시간 동안 저온 처리된 잎으로부터 제작된 SAGE library에서 27,612개의 태그를 분석하였고, LongSAGE 방법을 도입함으로써 기존 SAGE에서 나타나는 태그 확인의 모호성을 부분적으로 해결할 수 있었다. 초기 저온 반응에서 발현된 유전자들의 기능 분류로부터 정상 조직에서 높은 발현을보이는 광합성의 광반응 관련 유전자들이 초기 반응에서는 상대적으로 낮은 수준으로 발현되었으나, ATP 합성 관련 유전자의 발현은 정상 조직에 비해 증가하였다. 정상 조직의 유전자와 저온 초기에 발현되는 유전자의 비교에서 315개의 유전자가 차별적(p <0.01)으로 발현되었으며, 이들 유전자 중 세포벽 강화, 신호 전달, 이동·수송 기능 강화, 호르몬 대사, 지질 대사, ATP 합성, 아미노산 대사에 관여하는 유전자들의 발현이 증가하였고, 광합성에 관여하는 유전자들은 대조적으로 감소하였다. 초기 반응에서 차별적 반응을 보이는 유전자의 기능과 전달 경로 연구를 통해서 다음과 같은 초기 신호 전달에 대한 심화된 이해가 가능하였다. 칼슘을 매개로 한 신호 인지, 키나아제(kinase), 전사 인자(transcription factor)를 통한 저온 스트레스 신호 전달 기능이 초기 반응에서 현저하게 강화되어 나타났다. 식물이 저온 환경에 노출되었을 때 다양한 적응 전략이 저온 초기에 나타났다. 저온 초기 반응에서는 오스모라이트(osmolyte), 항산화제 (antioxidant), 활성 산소 제거제(ROS scavenger)의 기능이 세포의 일차적 보호 전략으로 수반되었으며, 적응을 위한 순화 메커니즘이 시작됨과 동시에 저온에 대한 쇼크반응도 동반되었다. 초기에 당과 아미노산 수송기능 유전자들의 감소는 저온에 의한 쇼크반응의 효과로 판단되었으나, 저온 초기 감소하는 광합성 기능은 쇼크반응과 적응이 동시에 내재되어 있었다. 광합성 과정에서 빛을 받아들이는 PSII 유전자의 발현 감소는 과잉의 빛으로부터 광합성 시스템을 보호하는 적응 방법이며, 이 연구로부터 저온 반응과의 관계에서 잘 알려지지 않은 살리실산(salicylic acid), 질소와 암모니아 고정과의 상관관계가 제시되었고, 특히 동물의 스트레스 반응에서 잘 알려진 포도당 신생합성(gluconeogenesis) 대사가 식물의 저온 반응에도 포함되는 것으로 나타났다. 정상 조직, 저온 초기 반응 조직, 저온 후기 반응 조직으로부터 작성된 세 가지의 SAGE library에서 얻어진 태그의 정보를 바탕으로 저온에 대한 반응성을 보이는 유전자를 선택하여 1.4K Coldstresschip을 제작하였으며, 이를 이용해 저온 순화 과정에서 시간의 흐름에 따른 유전자 발현 변화를 파악하였다. 동시 발현 유전자 세트(co-expressed gene sets)를 이용한 GSEA 분석을 도입함으로써 Coldstresschip의 작은 규모로부터 야기되는 제약을 극복하였다. 발현 변화 패턴을 기초로 초기 중기 후기 반응으로 나눌 수 있었으며, 초기에서 후기 반응의 신호흐름은 SAGE library의 태그 분석에서 기능과 전달 경로를 기초로 한 결과와 일치했다. 이 분석을 통해 각 단계에서 발현 증가를 보이는 유전자 세트의 정보는 저온 스트레스 환경에서 특정 기능과 전달 경로에 포함되는 유전자의 상호관계를 이해하는 데 중요한 바탕이 될 수 있다. 저온 순화에 대한 이해를 바탕으로 회복(deacclimation)과 재순화 (reacclimation) 과정에서의 유전자 발현을 1.4K Coldstresschip을 이용하여 분석하였다. 저온 회복에서의 유전자 발현은 저온 순화의 발현 양상과 정반대로 나타났다. 무처리(non-treated)와 저온 회복의 비교 분석에서 엽록소 결합(chlorophyll binding), 전자 운반 활동(electron carrier activity), xanthrophyll 결합과 같은 광합성 관련 기능은 무처리보다 저온 회복 과정에서 현저하게 증가되었으나, 초기 신호 전달 (signaling) 중 칼슘 이온 결합(calcium ion binding), 키나아제 활동(kinase activity), 전사 인자의 발현은 무처리보다 감소하였다. 재순화 과정에서는 회복과정에서의 변화가 그대로 투영되어 광합성 기능이 강화되었고, 회복과정에서의 저온 초기 신호 전달 약화는 재순화 과정에서 저온 내성 증진 효과를 갖는 많은 촉매 활동(catalytic activity) 유전자들의 발현 감소를 야기하였다. 애기장대의 저온 순화 초기의 이해를 바탕으로 47개의 결실돌연변이체(knockout mutant)로부터 얻어진 섭동된 유전자 발현 데이터(perturbed gene expression data)에 CLR 알고리즘을 적용하여 저온 초기 네트워크를 구성하였다. 이를 유전자 세트로 구성하고 동시 발현 유전자 세트를 함께 이용해 차별적 저온 내성을 갖는 식물 중 i) 애기장대 esk1 돌연변이체와Cvi 생태형(ecotype), ii) 6개의 십자화과 작물, iii) 1개의 박과 작물에서 저온에 대한 차이를 진단하였다. 저온 반응 진단 결과, 차별이 되는 유전자 세트 중 ZAT10, nucleolin, serine/threonine 단백질 키나아제를 통한 차이가 차별적 내성에 핵심적인 기여를 하였으며, 이러한 유전자는 주로 ABA-independent pathway의 중심에 존재하는 유전자 세트였다. 결론적으로 저온 내성 증진에서는 ABA-independent pathway가 더 직접적으로 관여하였으며, 하나가 아닌 몇 가지 원인 유전자 세트의 복합적인 효과가 저온 내성 정도를 결정하는 것으로 나타났다. 동시 발현 유전자 세트 분석을 통해 다른 작물에 비해 애기장대에서 광합성 기능과 단백질 합성 기능이 강화되어 나타났으며, 이러한 원인 또한 저온 내성에 기여하는 것으로 보였다. 애기장대의 microarray를 사용하여 염기 서열 유사성이 높은 십자화과에 속하는 작물뿐 아니라 염기 서열 유사성이 떨어지는 박과 작물에서도 차별적 저온 반응의 진단이 가능하였다. 본 연구에서 제작된 Coldstresschip은 경제적 유용성이 있는 십자화과와 박과 작물의 저온 반응 진단에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대되며, 이 연구에서 진행된 저온 반응의 이해와 저온 내성 진단을 통해 얻어진 결과는 경제적으로 유용한 식물을 위한 응용에서 귀중한 자료가 될 것이다.