Functional Characterization of Ubiquitin C-terminal Hydrolase-L1 in NCI-H157 cells

Abstract

Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 (UCH-L1) is a deubiquitinating enzyme which catalyzes hydrolysis of ubiquitin ester and amides, and plays an important role in protein degradation through recycling free Ubiquitin (Ub) by cleaving ubiquitylated peptides. This enzyme is an abundant neuronal tissue but recently was reported as a marker that has a potential role in carcinogenesis. However, the molecular mechanism of biological function of UCH-L1 in tumor was poorly understood. Additionally, its variants related with tumor progression were reported in lung cancer but also its molecular mechanism has not been studied well. In this study, I have examined the regulatory mechanism of UCH-L1 focused on tumor metastasis and cellular functions of N-terminal truncated UCH-L1 (NT-UCH-L1) among various UCH-L1 variants in NCI-H157 lung cancer cells. To understand the biological role of newly found NT-UCH-L1 in NCI-H157 cells, cDNA microarray and proteomics were employed. In the first part, the effect of UCH-L1 on the cell migration required for cancer metastasis was examined because it was reported that UCH-L1 is specifically overexpressed in various highly invasive cancer cells according to their progression. We found that UCH-L1 was overexpressed in highly invasive NCI-H157 cells although they belong to non-small cell lung cancer (NSCLC). This suggests that UCH-L1 expression level is closely related with lung cancer cell migration and metastasis. To validate the idea, the migration assay in vitro was performed using the transwell coated Matrigel™ in UCH-L1 transiently transfected cells. In a dose dependent manner, UCH-L1 increased the cell migration. In vitro results were confirmed with gain and loss of function using established stable cell lines. Cell migration assays in UCH-L1 stably overexpressed and stably knock-downed cells were assessed and it was found that cell migration was regulated by the UCH-L1 expression level. Finally, to examine whether UCH-L1 regulates the cell migration in vivo, cell migration assay was performed using the animal model. The pulmonary metastasis in BALB/c nude mice by UCH-L1 knock-downed B16F10 melanoma cells by RNAi was decreased. The results suggest that UCH-L1 is a key regulatory molecule in cell migration and cancer metastasis in vitro and in vivo. Activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is a measure of various cellular processes; cell proliferation, stress response, apoptosis, cell migration and angiogenesis. To understand the role of UCH-L1 in cellular signaling, MAPKs signaling pathway was observed in UCH-L1 knock- downed cells. The activation of JNK and p38 MAPKs in response to heat shock were more rapidly increased but immediately decreased at early time during recovery in NCI-H157 cells expressing the UCH-L1 specific RNAi than in control cells. On the other hand, no discernible differences in Akt and ERK signaling pathway were observed in UCH-L1 knock-downed NCI-H157 cells. The activation of JNK and p38 MAPKs is generally associated with promotion of apoptosis related to reactive oxygen species generation, while ERK activity inhibits apoptosis. These results suggest that UCH-L1 expression modulates the JNK and p38 MAPK signaling pathway and is involved in the survival in invasion. Significant cell morphology changes depending on the expression level of UCH-L1 were observed, however, this change was turned out not related to cell cycle. Since cell morphology is the result form cytoskeleton rearrangement, small GTPases play important roles in metastasis by regulating the organization of the actin or myosin cytoskeleton. These suggest that small GTPases can be involved in UCH-L1 induced morphological change and metastasis. To validate this hypothesis, the activation of Rac1 in response to heat shock was assessed by modulating the expression level of UCH-L1. The activation of Rac1 was more increased in NCI-H157 cells expressing UCH-L1 specific RNAi than control irrelevant RNAi. Next, the focal adhesion, a downstream of Rho, was disrupted in NCI-H157 cells expressing UCH-L1 specific RNAi. This result demonstrates that UCH-L1 is involved in the regulation of small GTPase–mediated cell migration and the loss of this regulation by UCH-L1 RNAi results in imbalance among small GTPase activation. In the second part, the cellular functions of newly found novel N-terminally truncated variant (NT-UCH-L1) was studied. Post-translational modification of UCH-L1 as a variant was not reported yet, but the O-glycosylation is reported with the localization of UCH-L1 in nerve terminal. In our previous study, the four variants of UCH-L1 was detected using 2D-gel electrophoresis and identified by mass spectrometry. N-terminally truncated eleven amino acids were observed in NT-UCH-L1 by mass spectrometry and Western analysis using anti-N terminal peptide antibody. NT-UCH-L1 lost the ubiquitin hydrolase enzyme activity using ubiquitin-7-amino-4-methylcoumarin (Ub-AMC) as an artificial substrate in vitro and in vivo. In the structure of NT-UCH-L1, the truncated region, MQLKPMEINPE, is corresponding to exon 1 of Uchl1 gene. It was reported that there are two Ub binding residues, 7E and 11E in this region by X-ray crystallography. Therefore, NT-UCH-L1 could not bind the monoubiquitin and then the ubiquitin C-terminal hydrolase activity was not detectable when Ub-AMC was used as a substrate regardless the intact active site. Using immunoprecipitation and mass spectrometry, two new binding proteins for NT-UCH-L1 were identified as HSC71 and HSP70. To examine whether NT-UCH-L1 has the effect on cell migration like UCH-L1, the migration assay was performed using transwell coated with Matrigel™. However, no discernible changes in cell migration of NT-UCH-L1 overexpressing cells were observed. These findings suggest that NT-UCH-L1 has no affinity for monoubiquitin in cells and the cellular function of NT-UCH-L1 may be different from UCH-L1 because the binding protein was changed and the UCH-L1 hydrolase activity is required for cell migration. Important findings of NT-UCH-L1 were achieved using mass spectrometry and Western analysis. NT-UCH-L1 is monoubiquitinated at two lysine residues and one of them is a lysine 146 residue on the loop. Monoubiquitination is very important modifications in various cellular processes including receptor sorting to lysosomal degradation, inhibition of the capacity of binding to substrate, subcellular relocalization and regulation of transcription activity etc.. The effect of monoubiquitination of NT-UCH-L1 in subcellular localization was examined by heat shock. Using the confocal fluorescence microscopy and cell fractionation, both of UCH-L1 and NT-UCH-L1 is localized in cytoplasm and membrane, while only monoubiquitinated NT-UCH-L1 is localized in nucleus. These localizations were not changed by heat shock. The results suggest that NT-UCH-L1 is translocalized from cytoplasm to nucleus by monoubiquitination and monoubiquitinated NT-UCH-L1 may be involved in cellular transcription regulation in nucleus. To determine whether NT-UCH-L1 affects the transcriptional regulation, cDNA microarray and differential expression proteomics were carried out. Differentially regulated gene or proteins were identified. These genes or proteins can be grouped according to their functions. In NCI-H157 stable cells expressing UCH-L1, only one gene (Ub C, mRNA) was up-regulated and one gene (Stearoyl-CoA desaturase, mRNA) was down regulated. This result suggests that UCH-L1 regulates the expression of Ub in cells and controls the biological function related with Ub as known so far. In NCI-H157 stable cells expressing NT-UCH-L1, 10 genes were up-regulated and 27 genes were down-regulated. Up-regulated genes can be grouped according to their functions. Among them, FASN (fatty acid synthase) mRNA acting as esterase, RBPMS2 (RNA-binding protein with multiple splicing2) mRNA binding to nucleic acid, SCD (Stearoyl-CoA desaturase) acting as oxidoreductase, IDH2 (isocitrate dehydrogenase 2) mRNA acting as dehydrogenase, and RGS4 (regulator of G-protein signaling 4) mRNA acting as G protein modulator were identified. Among down-regulated genes, TGFB1 (transforming growth factor) mRNA acting as cell adhesion molecule, HSPA5 (heat shock 70 kDa protein 5) and TRA1 (tumor rejection antigen 1) mRNAs acting as chaperone, SDCCAG10 (glucose regulated protein) and ERP70 (protein disulfide isomerase related protein) mRNAs acting as isomerase were identified. Specifically, TRA1 [heat shock protein 90kDa beta (Grp94)] encode HSP90 beta protein. It was found that this Grp94 protein expression is reduced in NCI-H157 stable cells expressing NT-UCH-L1 using 2D-gel electrophoresis and nano-LC-ESI-q-TOF MS. Using 2D gel electrophoresis and nano-LC-ESI-q-TOF MS, the differentially expressed proteins were identified in NCI-H157 stable cell line expressing NT-UCH-L1 in comparison to NCI-H157 control cells. It was found that the expressions of heat shock protein HSP 90-beta, 78 kDa glucose-regulated protein precursor, and protein disulfide-isomerase precursor related with chaperone and protein folding are reduced in NCI-H157 stable cell line expressing NT-UCH-L1. Additionally, it was found that the expressions of endoplasmin precursor, 78 kDa glucose-regulated protein precursor, and 14-3-3 protein zeta/delta related with anti-apoptosis are reduced. These results suggest that NT-UCH-L1 may be involved in the regulation of stress-induced chaperone functions.;UCH-L1은 다른 조직의 정상 세포에는 존재하지 않으면서 특이적으로 신경조직에만 1~2% 양으로 존재하는 ubiquitin C-terminal 가수분해 효소이다. 이러한 UCH-L1이 최근에 여러 암의 발병 진행 정도에 따라 그 발현이 특이적으로 증가하는 것으로 보고되었으며, 특히 폐암에 있어서는 암전이 정도에 따라 UCH-L1의 발현이 현저하게 증가되어 있는 것이 임상학적 연구결과로 보고되었다. 여러 폐암세포주군에서 전이성이 높지 않은 것으로 알려진 NSCLC (non small cell lung carcinoma)에 속하는 여러 폐암 세포주를 대상으로 세포이동 정도를 Matrigel™이 코팅된 transwell을 이용하여 실험한 결과 NCI-H358 세포주와 NCI-H157 세포주는 세포이동도가 상이하게 달랐다. 이 두 세포주중 세포이동도가 매우 큰 NCI-H157 세포주의 세포내 단백질 발현 정도를 2D gel 전기영동으로 분리한 후 MALDI-TOF MS로 확인하여 세포이동도가 낮은 NCI-H1358의 결과와 비교 분석한 결과, UCH-L1이 세포이동도가 큰 NCI-H157 세포주에서 많이 발현되어 있다는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 사전 결과를 토대로 본 논문에서는 암전이와 UCH-L1과의 상관관계를 NCI-H157 폐암 세포주에서 연구하였으며, 세포내에 존재하는 UCH-L1의 여러 이성질체 중 N-terminal truncated UCH-L1 (NT-UCH-L1) 이성질체의 생물학적 성질을 NCI-H157 세포주에서 연구하였다. 암전이와 UCH-L1과의 상관관계를 조사하기 위해 먼저 UCH-L1이 전혀 발현되지 않는 HeLa 세포주에 외부적으로 UCH-L1을 과발현하여 HeLa 세포주의 세포이동도를 Matrigel™이 코팅된 transwell을 이용하여 조사하였다. UCH-L1이 발현된 양에 비례하여 HeLa 세포주의 세포이동도가 증가함을 관찰할 수 있었다. 또 다른 실험으로는 RNAi를 이용하여 NCI-H157 세포주내에 존재하는 UCH-L1 발현양을 감소시켜 그때의 세포이동도를 조사하였다. 그 결과 예상한 바와 같이 UCH-L1의 발현양이 RNAi에 의해 감소되자 NCI-H157 세포주의 세포이동도는 정상 대조군에 비해 감소함을 관찰할 수 있었다. 이러한 두 가지 사실로부터 UCH-L1은 암 전이와 연관된 세포이동도에 직접적으로 관여하고 있음을 알 수 있었다. 위의 얻어진 결과를 동물실험을 통하여 검증하고자 마우스 melanoma B16F10 세포주에 존재하는 UCH-L1의 발현양을 RNAi를 사용하여 감소시킨 후 일정량의 세포를 BALB/c nude 마우스에 i.v. 주사한 후 2주 후에 폐에 형성된 melanoma 세포의 colony를 조사하였다. 형성된 colony는 정상 대조군에 비하여 UCH-L1이 RNAi에 의해 발현양이 감소된 실험군에서 현저하게 감소되어 있는 것이 관찰되었다. 이러한 결과로부터 UCH-L1은 세포의 이동도에 직접적으로 관여하는 원인적 세포내 단백질임을 알 수 있었으며 이러한 UCH-L1이 암세포에서 발현되면 암전이를 유발함에 직접적으로 관여하고 있음을 알 수 있었다. 이러한 UCH-L1이 세포이동도에 어떻게 관여하고 있는지 알아보기 위하여 UCH-L1 RNAi를 이용하여 UCH-L1이 발현 저하된 NCI-H157 세포주를 이용하여 실험하였다. 먼저 UCH-L1이 발현 저하된 NCI-H157 세포주에서 세포모양이 변화되는 것을 관찰하였으며 이를 두 가지 가능성을 가지고 조사하였다. UCH-L1이 세포주기 (cell cycle)에 영향을 줌으로 인해 세포의 모양이 특정 세포주기에 머무르고 있는 것인지 아니면 small G 단백질이 UCH-L1에 의한 세포 모양 변화에 관여하고 있는지 알아보았다. UCH-L1이 발현 저하된 NCI-H157 세포주와 정상 대조군과의 비교 실험에서 UCH-L1 발현양에 의해 세포주기가 영향을 받지 않는다는 사실을 알 수 있었다. 또 다른 실험으로, small G 단백질의 관련 여부를 조사하였다. UCH-L1이 발현 저하된 NCI-H157 세포주에서는 Rac1이 정상 대조군에 비하여 상대적으로 많이 활성화되어 있는 것을 확인하였다. Rac1과 Rho protein은 서로 균형적으로 활성화되어 세포내에서 여러 세포반응에 기여한다. 이러한 균형이 상실되면 어느 한쪽으로 세포내 반응이 치우치게 된다. UCH-L1에 의해 이러한 균형이 유지되는지 아니면 변화되어 세포 이동도가 변화되는 것인지 알아보기 위해 이번에는 Rho 활성화가 되면 일어나는 focal adhesion 형성 정도를 paxillin을 이용하여 간접적으로 확인하고자 하였다. UCH-L1이 RNAi에 의해 발현 저하된 NCI-H157 세포주에서는 focal adhesion이 잘 형성되어 있지 않음을 관찰하였다. 즉, UCH-L1 RNAi에 의해 발현 저하된 NCI-H157 세포주에서는 Rac1이 정상 대조군에 비해 활성이 많이 되어 있는 것을 확인한 반면, Rho는 활성이 되어 있지 않음을 확임함으로써 UCH-L1이 이 두 small G 단백질의 활성화에 영향을 미치고 있음을 알 수 있었다. 아울러, UCH-L1이 세포 이동도를 조절함은 Rac1의 활성을 매개로 한 cell adhesion을 조절함으로써 이루어 진다는 사실도 판단 할 수 있었다. 다음으로 세포내 존재하는 UCH-L1의 이성질체에 대해 연구하였다. NCI-H157 세포주내에는 UCH-L1의 full form외에도 다른 네 종류의 이성질체가 존재함을 2D gel 전기영동과 MALDI-TOF MS로 알 수 있었으며 특히 NT-UCH-L1 이성질체가 존재함을 알 수 있었다. 이러한 사전결과를 토대로 본 논문에서는 NT-UCH-L1이 full form UCH-L1과 어떠한 성질이 다르고 같은지 알아보고자 하였으며, 최종적으로 NT-UCH-L1의 세포내 기능이 무엇인지 microarray와 proteomic 방법을 사용하여 그 세포내 기능을 유추해 보았다. 제일 먼저, NT-UCH-L1이 UCH-L1과 같이 가수분해 효소기능이 있는지 Ub-AMC를 기질로 사용하여 알아보았다. 그 결과 NT-UCH-L1은 UCH-L1과 같은 가수 분해 효소기능이 전혀 없음을 알 수 있었다. 또한 UCH-L1과 달리 세포이동도와 연관성이 없는 것으로 세포 이동도를 측정한 결과로부터 결론지을 수 있었다. 이러한 두 가지 사실은 NT-UCH-L1은 UCH-L1과 전혀 다른 세포내 기능을 할 것이라는 예측을 하게 하였고 그것을 확인하고자 세포내 결합단백질을 알아보았다. 그 결과 UCH-L1과는 달리 NT-UCH-L1은 chaperone 단백질인 HSC 71, HSP 70과 결합을 하고 있다는 것을 알 수 있었다. 또한 NT-UCH-L1은 monoubiquitination되어 있다는 사실도 밝혔다. Monoubiquitination은 최근에 endocytosis, DNA repair등 다양한 세포내 기능을 유도한다는 것이 보고되었다. 이러한 관점에서 NT-UCH-L1이 어느 lysine 잔기에서 monoubiquitination이 일어나는지 알아보고자 이미 발표된 여러 구조 논문을 통하여 예측하였다. UCH-L1은 효소 활성부위에 특정 loop이 존재하여 ubiquitin을 가수 분해 하는데 결정적인 역할을 하는 것으로 보고되었다. 이러한 loop 부위에 존재하는 146 lysine잔기에서 monoubiquitination이 됨을 NT(K146R)-UCH-L1 mutant를 통해 확인할 수 있었다. 다음으로 세포내의 NT-UCH-L1의 존재부위를 확인하고자 하였다. Monoubiquitination이 된 단백질은 상당 부분 세포내 위치가 변화된다. 이러한 사실을 NT-UCH-L1에서도 확인해 보고자, 또한 세포내 기능을 유추해 보고자 confocal 현미경을 이용하여 세포내 NT-UCH-L1의 존재 부위를 확인하였다. 그 결과 NT-UCH-L1은 monoubiquitination이 되면 cytosol에서 nucleus쪽으로 이동한다는 것을 알 수 있었다. Monoubiquitination된 NT-UCH-L1은 nucleus쪽으로 이동하여 세포내 transcriptional 조절을 할 것이라는 예측하였고, 이것을 확인하고자 microarray를 이용하여 UCH-L1이 과발현 된 세포와 NT-UCH-L1이 과발현된 세포주에서의 유전자 발현정도를 비교 확인하였다. 그 결과 UCH-L1이 과발현 된 경우 세포내 Ub C mRNA가 증가함을 관찰하였고 stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase) (SCD) mRNA가 의미있게 감소함을 알 수 있었다. 이와는 다르게 NT-UCH-L1이 과발현된 세포주에서는 stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase) (SCD) mRNA가 의미있게 증가할 뿐만 아니라 HSP70/ 90 family chaperones, cell adhesion molecule, defense/immunity protein, isomerase, dehydratase, receptor, signaling molecule, synthetase, transcription factor, transferase 와 같이 여러 세포내 기능 단백질이 감소함을 알 수 있었다. 특히 chaperone관련 mRNA 감소는 2D-gel 전기영동과 nano-LC-ESI-q-TOF MS를 이용하여 차별적으로 발현양이 감소한 단백질을 조사했을 때의 결과와 일치하였다. UCH-L1이 과발현된 또는 NT-UCH-L1이 과발현된 NCI-H157 세포주에서 확인 한 결과 NT-UCH-L1이 과발현된 경우, 세포내 단백질 중 heat shock protein HSP 90-beta, 78 kDa glucose-regulated protein precursor, protein disulfide-isomerase precursor가 감소함을 알 수 있었으며 anti-apoptosis관련 단백질 endoplasmin precursor, 78 kDa glucose-regulated protein precursor, 14-3-3 protein zeta/delta도 함께 감소함을 알 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 세포내 stress 관련 세포내 기능에 NT-UCH-L1이 관여하고 있음을 알 수 있었다.