철 포르피린 화합물에 의한 DNA 절단 반응

Abstract

금속 포르피린은 생체 내 물질을 광화학적 방법으로 손상시키며, 종양 세포에 대한 좋은 친화도를 나타내는 화합물이다. DNA 절단 반응에 관여하는 화합물은 항암제로서 그리고 인공제한 효소의 개발 및 DNA footprinting과 3차원적 구조 분석의 probe로서 이용되어 왔다. 본 연구에서는 철-포르피린 착물이 DNA 절단 반응을 일으키는 현상을 관찰하였다. 본 실험에서 사용한 철-포르피린[Fe(Ⅲ)(TMPyP)^(5+), iron(Ⅲ)(meso-tetrakis(4-N-methylpyridy)porphyrin)] 착물은 산화제 없이 plasmid pGEM-7zf(+) DNA 절단을 일으켰다. DNA 절단 반응을 agarose gel electrophoresis로 확인할 경우, agarose에 존재하는 환원제 성분이 Fe(TMPyP)을 activation하여 상당한 DNA autocutting이 일어나는 이유로, 이를 방지하고자 sodium cyanide(NaCN)로 반응을 quenching하였다. Buffer(pH 7.0)의 종류에 관계없이 동일한 반응성을 나타내었고, Fe(TMPyP)의 농도, 반응 시간에 비례하여 DNA 절단 반응이 일어났다. Radical quenching 실험을 통해 반응 종이 diffusible free radical이 아님을 밝힐 수 있었고, 절단 반응에 환원제(DTT)와 산화제(oxone)를 첨가할 경우, DNA의 절단 효율성이 증가하였다. Fe(TMPyP)에 의한 DNA 절단 반응은 산소에 관계없이 일어나며 이 결과들로 부터 oxidation이 아니라 hydrolysis에 의해 DNA 절단 반응이 일어난다고 추정할 수 있었다. Hydrolysis의 증거가 되는 절단되 DNA의 religation은 Fe(TMPyP)가 T4 DNA ligase의 inhibitor로 작용하기 때문에 판단하기 어려웠다. Stopper NaCN 처리에 관계없이, Fe(TMPyP)가 pGEM-7zf(+)DNA의 동일 한 위치를 절단하는 것을 southern blot으로 확인하였다. 또한 이 화합물은 pBS Ⅱ KS(+) DNA의 supercoil, relax, linear form에 관계없이 동일한 위치를 절단하였다. pBS Ⅱ KS(+) DNA에 제한효소를 처리하여 얻은 97, 194, 257 bp fragment에 Fe(TMPyP)를 24 시간, 37℃에서 반응시켜 10%, 12% denaturing polyacrylamide gel에서 전개한 결과, AT 염기 서열에서 절단되는 선택성을 보였다.;In our approach to understand metal-mediated DNA modifications, we studied DNA cleavage by iron porphyrin complex in the absence of terminal oxidant. When [Fe(Ⅲ)(TMPyP), Iron(Ⅲ)(meso-tetrakis(4-N-methylpyridyl) porphyrin)] was incubated with DNA at physiological pH and temperature, the degradation of DNA was observed. The cleavage of DNA was followed by monitoring the conversion of plasmid pGEM-7zf(+) supercoiled DNA (form Ⅰ) to an open circular (form Ⅱ) and a linear (form Ⅲ). In order to inhibit autocutting process by a reductant in agarose, all reactions were treated with a stopper such as NaCN. In the presence of buffers(pH 7.0) such as phosphate, tris, HEPES, and MOPS buffer, the reaction appeared the same extent of cleavage. The addition of radical scavengers such as DIMSO, ethanol, t-Butanol, methanol, mannitol, and sodium formate did not affect the DNA cleavage, indicating that diffusible free radicals were not responsible for the DNA degradation. The addition of reductant(i.e., dithiotheitol) and oxidant(i.e., oxone) dramatically increased the effectiveness of DNA cleavage by Fe(TMPyP). Since we found that the degree of DNA cleavage was not affected by the presence of O_(2), we suggest that the DNA cleavage occurs via hydrolytic mechanism. The cleaved site of plasmid pBS Ⅱ KS(+) DNA of supercoil, relax, and linear form by the iron porphyrin complex was found to be identical. To further characterize DNA cleavage by the iron porphyrin complex, the compounds were reacted with restriction fragments of 97, 194, and 257 bp DNA 5'-labeled with^(32)P. The specificity of the cleavage reaction was examined by 10% and 12% denaturing polyacrylamilde gel electrophoresis. The results demonstrate that the site of DNA cleavage by Fe(TMPyP) is AT sequence.