The mechanisms of angiotensin II type 1 receptor (AT_(1)R)-mediated superoxide generation

Abstract

AngiotensinII (AngII) has been shown to participate in both physiological processes, such as sodium and water homeostasis and vascular contraction, and pathological processes, including atherosclerosis and hypertension. The effects of AngII in pathological processes were mediated by the activation of NADPH oxidases resulting in the production of superoxide (O^(2-)). But, the signaling mechanisms by which AngII activates these oxidases are unclear. The AngII-induced activation mechanism of NADPH oxidase 1 (Nox1) and NADPH oxidase 2 (Nox2) in HEK293 or CHO cells was studied. To investigate the essential components of Nox complex, AngII-induced superoxide generation was measured in HEK293 cells expressing Nox1 and Angiotensin II type 1 receptor (AT_(1)R), and its related cytosolic cofactors, Nox organizer 1 (NOXO1), and Nox activator 1 (NOXA1) or Nox2, AT1R, p47^(phox) and p67^(phox). NOXO1/NOXA1 and p47^(phox)/p67^(phox) were revealed to be essential components for the AngII-induced activation of Nox1 and Nox2, respectively. Generation of superoxide in HEK293 cells expressing Nox2/p47^(phox)/p67^(phox) was higher than that of cells with Nox1/NOXO1/NOXA1. Although strength of both Nox isozymes activation is different, results indicated that activation of AT_(1)R might be coupled to both Nox1 and Nox2, independently. To determine the upstream signaling mechanism of the AngII-induced activation of Nox1 or Nox2, several AT1R mutants were expressed and showed that interaction of the receptor with G proteins, but not that with beta-arrestin or with other proteins (Jak2, phospholipase Cr1, SHP2) that bind to the COOH-terminal region of AT_(1)R, was necessary for AngII-induced superoxide production. Evaluation of the effects of constitutively active alpha subunits of G proteins and of various pharmacological agents suggested that signaling by a pathway comprising AT_(1)R, Gα_(q/11), phospholipase Cr (PLC-r), and protein kinase C (PKC) was largely, but not exclusively, responsible for Ang II-induced activation of both Nox1 and Nox2 complexes in the reconstituted cells. A contribution of Gα_(12/13), phospholipase D (PLD), and phosphatidylinositol 3-kinase to AngII-induced superoxide generation was also suggested, whereas Src, and the epidermal growth factor receptor did not appear to participate in AngII-induced superoxide generation in reconstituted HEK293 cells. The small GTPase, Rac1 seemed to be involved in the AngII-induced activation of Nox2 but not of Nox1 in HEK293 cells. As shown in Part I, PKC was the promising regulator in both of Nox1 and Nox2 complex. PKC is well-known key-regulator of Nox2 system by phosphorylation of p47^(phox). However, there is no report that phosphorylation of any of Nox1 components is important for the regulation of Nox1 activity. In Part II, it was determined whether Nox1 component is phosphorylated by PKC. Activated HEK293 cells expressing Nox1, NOXO1-HA, and NOXA1-HA by PMA were labeled with isotope and then subjected to immunoprecipitation with antibody against HA. The results showed that NOXA1 was phosphorylated by PKC. And PMA-induced phosphorylation of NOXA1 was abolished by inhibition of PKC. Two possible PKC phosphorylation sites of NOXA1 were found using bioinformatic programs. To examine possible NOXA1 phosphorylation sites, point mutated forms of NOXA1 (S172A and S336A) were made. Expression of NOXA1 mutants (S172A, S336A) into HEK293 cells resulted in partial reduction of PMA-induced Nox1 activation. The effects of AngII-induced superoxide generation on downstream signaling pathway (MMP2 and 9 in this thesis) in Nox1 or Nox2 reconstitution system were further investigated. Reconstitution of different isotypes of Nox resulted in the expression of different types of matrix metalloproteinases (MMPs) after stimulation of Ang II in HEK293 cells. Nox1 or Nox2 reconstitution in HEK293 cells significantly decreased MMP2 expression with stimulation of AngII. HEK293 cells expressing Nox2 reconstitution system showed AngII-induced MMP9 mRNA expression. Even though the product of activated Noxes are the same as superoxide, the consequence of these reactive oxygen species (ROS) was different according to the isotypes of Nox. The difference may result from the different location or amount of ROS generated by different isotypes of Nox. This reconstitution system can be used to understand the mechanism of AngII to induce functionally active MMPs in a redox-sensitive manner. Since the induction of different isotypes of MMPs is well-known to occur during the development of complicated stages of atherosclerosis in human smooth muscle cells (SMC), understanding this mechanism could help to develop novel therapeutic targets. Taken together, reconstitution model of AngII-induced activation of Nox1 or Nox2 in HEK293 cells was established. All the data shown strongly suggest that sequential downstream pathway comprising G_(αq), PLC-beta and PKC is largely responsible for the Ang II-induced activation of Nox1 or Nox2. PLD2 also contributes to Ang II-induced superoxide generation. The expression of MMP-2 or MMP-9 in the reconstitution system is regulated Nox isotype specifically. In Part IV, the mechanism and subcellular location of the dotlike structural platelet-derived growth factor (PDGF)-induced H_(2)O_(2) generation were investigated in primary cultured Rat Aortic Smooth Muscle Cells (RASMC). Dotlike structural H_(2)O_(2) generation was almost abolished by treatment with hyperosmotic sucrose, cold incubation, or inhibition of PI3K by wortmannin, indicating that the regulation of this phenomenon might be involved in endocytosis. Future experiments will help us to understand the fuctional importance of NADPH oxidase-derived localized ROS production.;AngiotensinII (AngII)은 염분과 수분의 조절, 혈관수축과 같은 생리작용의 항상성과 동맥경화와 고혈압을 포함한 병리학적 과정에 모두 관여하는 호르몬으로 알려져왔다. 특히 병리학적 과정에서의 AngII의 영향은 superoxide(O^(2-))를 생성하는 효소인 NADPH oxidase를 통해 매게될 수 있음이 밝혀졌다. 그러나 어떤 신호 메커니즘을 통하여 AngII가 이러한 oxidases를 활성화 시키는 지에 관하여서는 확실히 밝혀지지 않고 있다. 이 논문에서는 AngII에 의해 NADPH oxidase 1 (Nox1)과 NADPH oxidase 2 (Nox2)가 활성화되는 기작에 관하여 HEK293 과 CHO cells에서 연구해보고자 하였다. Nox complex에서의 필수적인 요소가 무엇인지 알아보기 위해, Nox1과 Angiotensin II type 1 receptor (AT_(1)R), 그리고 관련된 세포질 단백질들(cytosolic cofactors), Nox organizer 1 (NOXO1)와 Nox activator 1 (NOXA1) 또는 Nox2, AT_(1)R, p47^(phox) 그리고 p67^(phox)을 발현한 HEK293 cells에서 AngII에 의해 활성화된 O^(2-) 의 생성을 측정하였다. 그 결과, NOXO1/NOXA1 그리고 p47^(phox)/p67^(phox) 이 AngII에 의한 Nox1 또는 Nox2의 활성화에 각각 꼭 필요하였다. HEK293 cells에서 O^(2-)의생성양은 Nox2/p47phox/p67phox 를 발현시켰을 때 Nox1/NOXO1/NOXA1를 발현시켰을 때보다 훨씬 많았다. 비록 Nox 동질효소(isozymes) 둘다 활성화되는 정도는 달랐지만, 결과는 AT_(1)R 가 Nox1과 Nox2에 각각 독립적으로 연결되어 있음을 보여주었다. AngII에 의해 유도되는 Nox1과 Nox2의 활성화의 상위 신호전달 매커니즘을 밝히기 위해서 몇몇 AT1R 변이체(mutants)들을 발현시켰고, b-arrestin이나 AT_(1)R의 COOH말단에 붙는 여러 단백질들 (Jak2, phospholipase C–γ1, SHP2)과의 결합은 연관이 없고 AT1R와 G단백들(G proteins)간의 결합이 제일 중요함을 보여주었다. Reconstituted cells에서의 구조적으로 활성화되도록 만들어진 G단백 α subunits의 영향과 다양한 억제약물들을 사용한 실험들의 결과로, AT_(1)R, Gα_(q/11), phospholipase C–β (PLC-β), 그리고 protein kinase C (PKC)로 이루어진 pathway가 AngII에 의한 Nox1과 Nox2의 활성화에 크게 관여함을 밝혔다. 또한 AngII에 의해 유도되는 O^(2-)의 생성에Gα_(12/13), phospholipase D (PLD)와 phosphatidylinositol 3-kinase도 중요함을 보여주었다. 반면에 우리가 사용한reconstituted HEK293 cells에서 Src과 epidermal growth factor receptor(EGFR)의 연관성을 볼 수 없었다. The small GTPase, Rac1은 AngII에 의해 유도되는 Nox2의 활성화에 관여하는 것을 볼 수 있었으나, Nox1의 활성화에 관여하는 것은 관찰할 수 없었다. Part I에서의 결과가 보여주는 것처럼, PKC는Nox1 과 Nox2 complex 모두에서 매우 중요한 요소이다. PKC는 p47^(phox) 를 인산화시키므로써, Nox2 system을 조절하는 것이 잘 알려져 있다. 하지만, 아직까지 Nox1 complex의 구성요소 중 어떤 것이 인산화되어 Nox1의 활성화를 조절한다는 보고는 없다. Part II에서는, Nox1 complex의 구성요소가 PKC에 의해 인산화될 수 있는지를 연구하였다. Nox1, NOXO1-HA 와 NOXA1-HA을 발현시킨 HEK293 cells을 PMA로 자극을 주어 활성화시킨 후, 방사선동위원소로 인산화된 부분을 표지해서 HA에 대한 항체(antibody)를 이용하여 immunoprecipitation하였다. 그 결과, NOXA1이PKC에 의해 인산화되는 것을 발견하였다. 그리고 PMA에 의해 유도되는 NOXA1의 인산화는 다시 PKC를 억제함으로써 막을 수 있었다. NOXA1에서 두개의 가장 가능성 높은 PKC 인산화 후보 site를 bioinformatic programs을 사용하여 찾아내었다. 이 인산화 가능성높은 site를 연구해보기 위해, 해당 site만 아미노산을 치환시킨NOXA1 (S172A and S336A) mutants를 제작하였다. 이NOXA1 mutants (S172A, S336A)를 HEK293 cells에 발현시키므로써 PMA에 의해 유도되는 Nox1의 활성이 부분적으로 감소되는 것을 확인하였다. Nox1 이나 Nox2 reconstitution system에서 AngII에 의해 유도된 O^(2-)의생성이 하부 신호전달pathway (이 논문에서MMP2 와 9) 에 미치는 영향을 연구해보았다. HEK293 cells에서 다른 종류의 Nox를 reconstitution하게 되면 AngII자극에 따라 다른 종류의matrix metalloproteinases (MMPs)의 발현이 조절됨을 확인하였다. HEK293 cells에서 Nox1 이나 Nox2 reconstitution을 하게 되면, AngII 자극에 의해 MMP2의 발현이 크게 감소하게 된다. Nox2를 reconstitution한 HEK293 cells에서는 AngII자극에 의해서MMP9 mRNA 가 특이적으로 발현된다. 비록Nox가 활성화되게 되면 isotype이 다르더라도 그 결과물은 O^(2-)로 같으나, 이 생성된 활성산소종의 영향은 다르게 나타났다. 이러한 차이는 Nox가 isotype에 따라 각기 다른 장소에서, 서로 다른 ROS를 내기 때문에 생겼을 수 있다. 이 reconstitution system은 AngII자극에 의해 유도되는 redox-sensitive MMPs의 활성화를 연구하고 이해하는데 도움을 줄 것이다. 사람의 평활근세포 (human smooth muscle cells, SMC) 에서 동맥경화가 진행되는 복잡한 과정에서 이러한 다른 종류의 MMPs가 활성화되는 것이 잘 알려져 있기 때문에, 이 mechanism을 이해하는 것은 미래에 새로운 치료방법을 개발하는데 기여할 것으로 기대된다. 결론적으로, 이 연구는Ang II에 의해 유도되는 Nox1 또는 Nox2의 활성화 reconstitution model을 확립하였다. 모든 결과들을 종합해보면, G_(aq), PLC-b 와 PKC 로 구성된 하부의 연속적인 pathway가 AngII에 의한 Nox1과 Nox2의 활성화에 크게 관여함을 밝혔다. AngII에 의해 유도되는 O^(2-)의 생성에 PLD2 역시 중요함을 보여주었다. 또한 MMP2와 9의 발현이 이 reconstitution system에서 Nox isotype에 따라 특이적으로 조절됨을 확인하였다. PartIV에서는, platelet-derived growth factor (PDGF)자극에 의해 H_(2)O_(2) 가 점과 같은 모양으로 세포내에 국지적으로 생성되는 매케니즘에 관하여 쥐의 대동맥으로부터 준비한 평활근 세포(Rat Aortic Smooth Muscle Cells, RASMC)를 사용하여 연구하였다. 이러한 H2O2 의 점과 같은모양의 국지적 생성은 hyperosmotic sucrose, cold incubation, 또는 wortmannin과 같은 PI3K의 억제제의 사용을 통하여 감소되었다. 이 결과는 이 특이한 현상이 endocytosis에 의해 조절되는 현상일 것을 제시한다. 앞으로도 NADPH oxidase에 의한 활성산소종의 국지적 생성메커니즘을 계속적으로 연구하여 그 의미와 중요성을 이해해보고자 한다.