Role of Astrocytes in Cancer and Inflammation in the Central Nervous System

Abstract

FasL 와 TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL)은 종양괴사인자의 구성원으로서 염증성 유전자의 발현 뿐만 아니라 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 논문의 1부에서 3부까지는 악성 뇌종양의 세포 고사를 일으키는 신호전달과정에서 세포의 운명을 결정짓는 분자적 기전에 대한 연구를 기술하고자 한다. 제 1부에서는 성상교세포에서 FasL에 의한 염증반응으로서 세포접합분자인 ICAM-1의 발현이 caspase 의존적으로 증가함을 확인하였다. 또한 악성 성상교세포종 환자 시료에서도 Fas의 발현이 정상 대조군에 비해 현저하게 증가되어 있었으며, 이는 ICAM-1의 발현 증가와 상관관계를 보였다. 이러한 결과는 악성 종양세포에서 FasL 자극에 의해 면역-염증 반응을 조절하는 새로운 내성 기전의 가능성을 제시한다. 제 2부에서는 TRAIL에 의한 세포사멸의 내성 기전으로서 유비키틴 프로테아좀 경로의 역할에 대하여 논하고자 한다. TRAIL은 종양세포에서만 선택적으로 세포사멸을 일으키는 것으로 잘 알려져 있으나, 여러 악성 종양에서 이에 대한 내성이 증가함에 따라 분자적 내성 기전의 연구가 절실한 상태이다. 프로테아좀 경로는 여러 조절 단백질의 분해 과정을 통해 세포 내 다양한 기능을 조절한다. 본문에서는 프로테아좀 경로가 억제되었을 경우 TRAIL에 의한 세포사멸이 수 시간 이내에 현저하게 증가되는 것을 관찰하였으며, 이는 활성화된 카스파아제-8과 3의 분해가 억제되어 일어나는 것임을 알았다. 프로테아좀 억제제는 TRAIL에 의한 NF-kB의 활성화를 저해하였으나, 이른 시간의 세포사멸의 증가를 설명하기에는 불충분하였다. 이러한 결과는 유비키틴 프로테아좀 경로가 NF-kB의 활성화 뿐만 아니라, 활성화된 caspase를 분해시킴으로서 TRAIL에 의한 세포사멸시 주된 방어 기전으로서 작용할 수 있음을 제시한다. 제 3부에서는 TRAIL에 의한 세포사멸의 또 다른 내성기전으로서 세포신호전달 과정의 조절자로서의 활성산소종의 역할을 서술하고자 한다. 연구 결과 성상교세포종에서 TRAIL에 의해 세포 내 활성산소종이 증가하였으며, 그 생성 기전으로서 caspase-3와 protein kinase C δ (PKC δ) 그리고 NADPH oxidase4 (NOX4)가 관여함을 확인하였다. 즉, PKC δ가 caspase에 의해 절단됨으로써 생성된 PKC δ의 촉매 부위가 NOX4를 활성화시켜 활성산소종의 생성을 유도하였다. 이렇게 생성된 활성산소종은 caspase-3의 산화성 변성을 초래하여 효소 활성화를 억제함으로써 TRAIL에 의한 세포사멸을 저해하는 것으로 나타났다. 염증반응은 외부의 여러 유해한 자극에 대한 방어 기전으로서 조직 손상의 회복을 돕는다. 뇌염증 반응과 성상교세포의 활성화는 영양인자등을 분비함으로써 신경세포의 기능을 회복하는데 이로운 역할을 하지만, 이와 더물어 세포 독성물질을 과하게 발현하여 신경세포의 손상을 유발할 수도 있기 때문에 양날의 칼과 같은 기능을 나타내게 된다. 특히 성상교세포의 활성화는 여러 퇴행성 질환에서 질병의 주된 병인과는 상관없이 공통적으로 나타나는 특징이기 때문에 성상교세포의 활성화에 따른 염증반응을 억제하기 위한 전략이 치료책으로서 제시되고 있다. 본 논문의 4, 5부에서는 퇴행성 질환의 병리과정에서 활성화된 성상교세포의 역할에 대하여 기술하고자 한다. 제 4부에서는 항 말라리아 약제로서 항 염증작용을 나타내는 것으로 알려진 클로로퀸의 작용 기전을 규명하였다. 그 결과 성상교세포에서 클로로퀸에 의해 세포 내 활성산소종이 증가하였으며, 이는 NF-kB의 활성화를 초래하여 염증성 매개체인 케모카인의 발현을 유도하였다. 반면에 소교세포에서는 클로로퀸에 의한 세포 내 활성산소종의 생성이 관찰되지 않았는데, 이는 클로로퀸이 소교세포에서는 항 염증반응을 보이지만 성상교세포에서는 오히려 활성산소종을 생성함으로써 염증반응을 유발하는 것으로 추정된다. 이는 뇌염증 반응을 보다 효과적으로 억제하기 위해서는 클로로퀸과 항산화제의 병합 처치가 필요함을 제시한다. 제 5부에서는 성상교세포가 면역-염증 반응을 수행하는데 유비퀴틴-프로테아좀의 역할을 논하고자 한다. 유비퀴틴-프로테아좀 경로는 NF-kB의 활성화를 매개하여 염증성 사이토카인의 신호전달 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 여러 퇴행성 질환에서 프로테아좀 경로의 기능 저하가 보고되어 있으며 특히, 알쯔하이머병에서는 유비퀴틴의 돌연변이 형태인 UBB+1이 발현되어 프로테아좀 경로의 기능을 전반적으로 저해하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 부분에서는 성상교세포에서 프로테아좀 경로의 기능 저하가 염증성 사이토카인의 신호전달에 미치는 영향을 살펴보았다. 프로테아좀 경로의 억제제 (MG-132)와 유전적 조작 (UBB+1 과발현)으로 프로테아좀 경로를 억제한 결과, 성상교세포의 세포사멸이 증가하였으며 염증성 사이토카인에 의한 케모카인의 발현이 전반적으로 억제되었다. 특징적으로 MG-132의 단독 처치와 UBB+1의 과발현에 의해서 IL-8의 발현이 증가하였으며, UBB+1이 과발현된 세포에서는 높은 MCP-1의 발현을 보였다. 염증성 사이토카인에 의한 케모카인의 발현에 관여하는 상위 신호전달과정에 프로테아좀 경로의 억제가 미치는 영향을 살펴본 결과, MG-132의 전처리에 의해 TNF-alpha에 의한 IKK의 활성화는 증가하였으나, IkB의 분해가 저해되어 NF-kB의 활성화가 억제되었다. 또한 JNK/AP-1의 활성화와 상위신호 과정인 MKK4의 활성화가 증가하였다. UBB+1의 과발현에 의해서는 TNF-alpha에 의한 IKK/ NF-kB 와 MKK4/JNK 경로의 활성화가 전반적으로 저해되었다. 이러한 결과들을 통해 프로테아좀 경로의 억제가 성상교세포에서 염증성 사이토카인의 신호전달과정에 이상을 초래하였음을 알 수 있었다. 따라서 노화나 알쯔하이머병에서 성상교세포의 병리학적인 역할은 프로테아좀 기능이 저해된 상황에서 재해석되어야 할 것이다. ;As members of the Tumor Necrosis Factor (TNF) family of cytokines, FasL and TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) have been shown to induce apoptotic cell death as well as expression of proinflammatory genes. In part I, II and III, I will delineate the molecular mechanism that determines the fate of cells upon death receptors ligation in brain tumors. In part I, I will explain the angiogenic property of FasL in vivo. FasL has been shown to transduce angiogenic and proinflammatory responses. Intercellular adhesion molecule (ICAM-1) is highly expressed in various human tumors, and is thought to be involved in metastasis and angiogenesis. I demonstrate that Fas ligation induces ICAM-1 expression at the mRNA and protein levels in astrocytoma cells. Studies using Boc-D-Fmk, a pharmacological inhibitor, show that caspase activation is required for Fas-mediated ICAM-1 induction. To study in vivo expression of Fas and ICAM-1, human low-grade astrocytomas and glioblastoma multiforme (GBM) samples were examined by ELISA for Fas and ICAM-1. Human GBM samples express higher levels of Fas compared to normal control brain, which correlates with increased expression of ICAM-1. These findings suggest that Fas ligation on astrocytoma cells leads to the induction of ICAM-1 expression, which involves the caspase signaling pathways. In part II, I will describe the molecular mechanism underlying resistance to TRAIL-induced apoptosis. TRAIL induces apoptotic cell death as well as expression of proinflammatory genes such as CXCL8 in malignant astrocytoma cells, however, the molecular mechanisms responsible for determing the fate of cells has not been fully understood. The ubiquitin (Ub)-proteasome pathway regulates a wide range of cellular functions through degradation of various regulatory proteins. I demonstrate here that inhibition of the Ub-proteasome pathway enhanced TRAIL-mediated cell death of human astrocytoma cells within hours by blocking degradation of active caspase-8 and 3. Proteasome inhibitors suppressed TRAIL-mediated activation of NF-kB; however, inhibition of the NF-kB pathway alone was not sufficient to enhance TRAIL-mediated cell death. Collectively, these results suggest that the Ub-proteasome pathway may play an important role as an anti-apoptotic surveillance system by eliminating activated caspases as well as mediating NF-kB-dependent signals. In part III, as another molecular mechanism responsible for resistance to TRAIL-induced cell death, I will describe the role of reactive oxygen species, especially hydrogen peroxide, as a signal modulator in TRAIL-mediated apoptotic signal. TRAIL causes apoptosis via caspase activation in various cell types, especially transformed ones. Numerous types of tumors are quite resistant to TRAIL-induced cytotoxicity; however, the molecular mechanisms responsible for the tumor resistance have not been fully understood yet. In part II, I have demonstrated that the Ub-proteasome pathway may play a role in resistance to TRAIL-mediated apoptosis. In addition, I report here a novel signal transduction pathway consisted of caspase-3, protein kinase Cd (PKCd), NADPH oxidase 4 (NOX4) and reactive oxygen species (ROS) that inhibits caspase-dependent cell death induced by TRAIL ligation in human astrocytoma cells. TRAIL ligation induced generation of intracellular ROS by a caspase-dependent proteolytic activation of PKCd and subsequent activation of the NOX4 complex. Suppression of intracellular ROS levels using various pharmacological inhibitors or RNAi constructs against PKCd and NOX4 enhanced the enzymatic activity of caspase-3 by blocking oxidative modification of the cystein residue of active caspase-3, resulting in marked augmentation of TRAIL-mediated cell death. These results collectively indicate that TRAIL can mediate activation of PKCd and NOX4 and subsequent generation of ROS, which modulate TRAIL-mediated apoptosis by an oxidative modification of active caspase-3 in a negative feedback manner. Inflammation is one of defensive responses following by noxious stimuli and helps restoring tissue damage induced by diverse insults. It has been a controversy whether neuroinflammation and glial activation are beneficial by exerting neurotrophic function or detrimental by overexpressing a variety of cytotoxic mediators. Therefore, neuroinflammation and glial activation has been considered as a double-edged sword in the central nervous system (CNS). Especially, glial activation is one of hallmarks of neurodegenerative diseases regardless of primary pathogenic etiology, therefore supporting the therapeutic potential of anti-inflammatory strategies in these diseases. In part IV and V, I will demonstrate roles of activated astrocyte in neuroinflammation in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. In part IV, I further examined the molecular mechanism responsible for chloroquine-induced activation of NF-kB and subsequent expression of chemokines by astroglial cells. Chloroquine, anti-malarial agent, has been shown to function as an anti-inflammatory and disease-modifying agent in a variety of autoimmune diseases. Previously, our group reported that chloroquine may evoke inflammatory responses in the CNS by inducing expression of pro-inflammatory cytokines by astroglial cells. I observed that chloroquine induced expression of chemokines such as CCL2 and CXCL8 in a dose- and time-dependent manner in human astroglial cells. Other lysosomotropic agents such as ammonium chloride and bafilomycin A1 had minimal effects on chemokine expression. Inhibition of NF-kB by MG-132 and TPCK suppressed chloroquine-induced mRNA expression of chemokines. Chloroquine increased the intracellular level of reactive oxygen species (ROS) in a dose- and time-dependent manner by human astroglial cells but not by monocytic/microglial cells. Chloroquine-induced increase of intracellular ROS level was suppressed by pre-incubation with diphenyl iodonium (DPI) and N-acetyl cysteine (NAC), which suppressed chloroquine-mediated activation of NF-kB and subsequent mRNA expression of chemokines in astroglial cells. These results collectively suggest that chloroquine generates ROS which is responsible for NF-kB activation and subsequent expression of pro-inflammatory chemokines in human astroglial cells. In part V, I will outline the role of the Ub-proteasome pathway on astrocytic functionality within the CNS. Impaired function of the ubiquitin proteasome pathway is one of the molecular mechanisms underlying neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease (AD). An aberrant form of Ub, UBB+1, can result in dominant inhibition of the Ub-proteasome system and is found in the brains of AD patients. Among many cellular functions, the Ub-proteasome pathway regulates immune responses by mediating NF-kB activation. Therefore, dysfunction of this pathway may affect the signaling of cytokines such as IL-1b and TNF-a, which are abundantly present in AD brains. Inhibition of the Ub-proteasome pathway exerted detrimental effects on cell survival and proliferation in astroglial cells. Inhibition of the proteasome pathway overall suppressed proinflammatory cytokine-induced chemokine expression measured as a read-out for IL-1b and TNF-a signaling. However, proteasome inhibition exerted differential effects on NF-kB and JNK pathways involved in chemokine expression. Overexpression of UBB+1 suppressed phosphorylation of IKK and JNK signaling pathway, while MG-132 enhanced phosphorylation of both IKK and JNK, but, inhibited proteasomal degradation and NF-kB activation upon TNF-a treatment. In addition, treatment of MG-132 alone induced IL-8 expression, while the same treatment suppressed the constitutive expression of MCP-1. UBB+1 stable cells showed high basal levels of MCP-1 and IL-8. These results suggest that inhibition of the Ub-proteasome pathway dysregulates proinflammatory cytokine signaling in astrocytes. Therefore, the pathological roles of glial cells should be re-evaluated under compromised functions of the ubiquitin/proteasome pathway in ageing brains or ageing-related neurodegenerative disorders.