The Study for mechanism of the invasion induced by EGF and TGF alpha in squamous cell carcinoma cell lines

Abstract

상피암 세포주인 SCC 12는 collagen으로 이루어진 기질에서 침윤할 수 있는 성질을 갖는 반면, SCC 13은 침윤하지 않는다. 이러한 세포주의 차이점을 규명하는 것은 암세포의 발전과정에서 어떠한 기작이 암침윤 능력을 가질 수 있게 하는 지를 알 수 있게 된다. 그 결과 암침윤 능력을 갖고있는 세포주인 SCC 12에서는 MMP와 그 기질의 발현이 암침윤 능력이 없는 SCC 13에 비해 상대적으로 높았으며, 일반적으로 침윤과정에 억제제로 작용하는 TIMP의 발현과 MMP와 결합하는 정도가 SCC 13에 비해 낮은 것으로 나타났다. 또한, 세포간 결합 물질로써 암침윤의 억제제로도 작용하는 것으로 알려진 E-cadherin 의 발현도 낮게 관찰되었다. 비 침윤성 세포주인 SCC 13 은 EGF와 TGF alpha를 장시간 처리하면 암 침윤이 유도되는 특성이 발견되었으나 EGF로 유도되는 암침윤 과정은 sheet를 형성하면서 이루어지는 반면, TGF alpha로 유도되는 암침윤 과정에서는 세포가 서로 떨어지면서 주변 조직으로 흩어지는 형태를 보인다. 이런 EGF와 TGF alpha에 의해 유도되는 암침윤과정에 MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2의 조절이 동시에 일어났는데, SCC 12 세포 주에서는 EGF와 TGF alpha에 의해 이들 단백질의 생합성이 증가되는 반면, SCC 13에서는 전혀 다른 반응이 관찰되었다. 즉, SCC 13은 EGF에 의해서는 반응을 하는데 비해 TGF alpha에 의해서는 반응하지 않는 것으로 나타났다. 이렇게 같은 수용체를 통해 반응한다고 알려진 EGF와 TGF alpha가 서로 다르게 암침윤을 유도하는 것은 이들이 이끄는 세포내의 신호전달 기작에 차이가 있음을 보여주는 것으로, 이를 증명하기 위해 먼저 이들 수용체의 활성 정도를 인산화와 internalization으로 조사하였다. 그 결과 EGF는 EGF 수용체의 internalization을 TGF alpha보다 촉진시키기 때문에 세포표면에는 더 적은 EGF 수용체가 존재하는 것으로 나타났으며, 이때 인산화 정도는 오히려 TGF alpha에서 보다 높은 것으로 밝혀졌다. 이러한 인산화의 유형은 MMP와 TIMP의 생합성 증가 유형과 비슷하였다. 또한, EGF 수용체와 c-erbB-2의 결합정도가 EGF와 TGF alpha의 서로 다른 반응을 일으키는 주요인 것으로 밝혀졌으나, 그 기작은 아직 명확하지 않다. 한편, SCC 13 세포가 TGF alpha의 처리에도 반응을 보이지 않는 원인을 조사하던 중 TGF alpha에 크게 반응하는 SCC 12 에 비해 상대적으로 높은 pro-TGF alpha의 발현정도를 갖는 것을 발견하였다. pro-TGF alpha는 TGF alpha로 분비되기 전에 세포막에 존재하는 형태로 EGF 수용체와 결합하고있는 것으로 확인되어, 이러한 결합이 EGF 수용체를 불활성 시킬 가능성뿐만 아니라 mature TGF alpha와의 결합 역시 저해할 수 있으므로, anti-sense TGF alpha transfectants/AS 세포를 제작하여 세포 내에서 pro-TGF alpha의 생물학적인 역할을 규명하고자하였다. pro-TGF alpha 의 발현 수준이 낮은 세포에서 TGF alpha에 의해 반응을 대조구인 SCC 13 세포와 비교하였다. 그 결과 TGF alpha의 단시간 처리가 오히려 MMP와 TIMP의 생합성을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이때 EGF 수용체와 heterodimer를 형성하여 EGF 또는 TGF alpha에 반응하는 c-erbB-2가 관여하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, c-erbB-2가 어떠한 기작으로 TGF alpha의 반응에 관여하고있는 지 본 연구에서는 확인되지 않았다.

핵심 되는 말 : 상피암 세포 주, 암침윤, EGF, TGF alpha, MMPs, TIMPs, EGF 수용체, c-erbB-2, pro-TGF alpha ; SCC 12 cells were able to invade into type I collagen gel matrix making invasive colonies but SCC 13 cells were not. The differences between SCC 12 and SCC 13 cells may determine the invading capacity. SCC 12 cells have elevated levels of MMPs, and their substrates, collagen, fibronectin and laminin than SCC 13 cells. As the negative regulators of invasion, TIMPs and E-cadherins were suppressed in SCC 12 cells. Moreover, repressed TIMPs were not able to make complexes with MMPs successfully but could make complexes with fibronectins, which probably inhibit access to MMPs. All the TIMP-2 secreted in the culture media preferentially make complexes with pro-MMP-2 neither MMP-1 nor MMP-9 based on our co-immunoprecipitation and gelatin zymography analysis. It was elucidated that TIMP-1 makes a complex with both 92 kDa pro-MMP-9 and 82 kDa activated-MMP-9 with neither MMP-1 nor MMP-2 by gelatin zymography of TIMP-1 immunoprecipitants. EGF stimulated the invasive transition of SCC 13 cells which were raft-cultured on type I collagen gel matrix, with distinct morphological property from that of TGF alpha. EGF induced invasion in a coherent type but TGF alpha did in a scattered one. As an attempt to elucidate the molecular basis for the invasive transition of SCC 13 cells as well as the differential responses between EGF and TGF alpha, we investigated the regulation of E-cadherin mediated intercellular adhesion, the induction pattern of MMPs and TIMPs and the MMPs/TIMPs complex formation, EGF receptor phosphorylation, and PKC activation at the different time after the ligand treatment. Both EGF and TGF alpha reduced alpha-catenin association to E-cadherin but only TGF alpha reduced E-cadherin expression in the long term treatment. EGF and TGF alpha stimulated both MMPs and their inhibitor TIMPs expression. However, their induction patterns were completely different each other even though two ligands were known to be bound to the same receptor, EGF receptor. In SCC 13 cells, long term EGF treatment caused the continuous induction of MMPs and TIMPs in a up-modulation pattern while the TGF alpha mediated inductions were less prominent and terminated at 60 hr treatment even in the continuous presence of the ligand. But in SCC 12 cells TGF alpha responses on MMPs and TIMPs were not terminated at 60 hr treatment, moreover, enhanced than EGF treatment. EGF receptor internalization influenced by phosphorylation status which was well correlated with MMP-1 induction was dominant in EGF treated cells than TGF alpha one. It may not a determinant of differential responses between EGF and TGF alpha because of the level of pro-TGF alpha and c-erbB-2 interacted with EGF receptor were responsible on the regulation of differential induction of MMPs and TIMPs. Since PKC-alpha and PKC-delta translocation to the membrane is also well correlated with the induction pattern of MMPs and TIMPs, they seem not to be involved in the termination of EGF receptor signal differently. Activities of ERK and PTPase were not directly correlated with the differential EGF receptor activation elicited either EGF or TGF alpha in SCC 12 and 13 cells. Therefore, the differential induction of MMPs and TIMPs in response to EGF and TGF alpha was not due to differential intracellular signaling pathway but the interaction status of EGF receptor with pro-TGF alpha and c-erbB-2. In spite of higher EGF receptor presence on the cell surface, the response of long term treatment of TGF alpha was completely terminated, which may suggest that EGF receptors on the surface are non-functional in terms of interaction with pro-TGF alpha. The role of pro-TGF alpha was examined in SCC 13 cells transfected with anti-sense TGF alpha designated AS cells. AS cells showed the activation pattern of MMPs and TIMPs responded with EGF or TGF alpha, which was different from that of parental SCC 13 cells. c-erbB-2 was involved in these responses interacting with pro-TGF alpha which was expressed in low level. But the signaling pathway of c-erbB-2 elicited by pro-TGF alpha was not defined clearly in this study, it has to be studied in the future.

Key words : squamous cell carcinoma, invasion, EGF, TGF alpha, MMPs, TIMPs, EGF receptor, c-erbB-2, pro-TGF alpha