한국인 집단에서 Short tandem repeat(STR) markers의 DNA 다형현상

Abstract

인류집단의 유전적 다형현상 (genetic polymorphism)을 분석하기 위한 새로운 분자 생화학적 기술의 발전으로 DNA염기 서열상에서의 유전적 변이성에 대한 많은 자료가 축적되고 있다. 이들 중 반복서열의 반복 수에 근거한 DNA 다형현상을 나타내는 유전적 마커들은 유용한 정보들을 제공한다. 따라서 본 연구는 마커로써의 유용성이 높기 때문에 최근 연구가 활발히 집중되고 잇는 (dC-dA)(dG-dT)n dinucleotide repeat sequences에 근거한 21개의 short tandem repeat (STR) 마커 들에 대한 대립유전자와 유전자형의 빈도 분포 및 그들의 유용성 (informativeness)을 분석하여 이들 유전적 마커(genetic marker)에 대한 한국인 집단의 유전적 특성을 파악하고자 하며 이러한 STR마커들의 다형현상을 개인 식별 및 친생자 확인에 적용하여 그의 유용성을 평가하고자 한다. 그 결과들은 다음과 같다. 1. genomic DNA를 형광으로 표식한 primer를 이용하여 증폭하고 그 산물을 672 Genescan software를 갖춘 automated sequencer를 통해 분석하는 방법의 정확도와 정밀도를 평가한 결과, band크기 측정값의 평균표준 편차가 lane과 lane사이에서는 ±0.212 bp, gel간에서는 ±0.329 bp, 따로 방응시킨 증폭산물들을 같은 gel상에서 전기 영동한 경우에는 ±0.265 bp, PCR 반응과 전기 영동을 따로 시험한 경우에는 ±0.411 bp의 값을 보였으며, 3가지 형광 dye에 따른 차이는 거의 없었다. 증폭산물의 크기 측정값의 평균 정확도와 정밀도는 21개의 STP마커들에 대해 각각 99.48%와 99.83%로 상당히 높았다. 따라서 이러한 방법은 높은 정확도와 정밀도를 나타내기 때문에 각 대립 인자들을 분명하게 규정 지을 수 있었다. 2. 한국인 집단의 81 내지 233 명의 개체에 대해 염색체 5번 (D5S416 좌위), 10번 (D10S201 좌위), 12번 (D12S85 좌위), 17번 (D17S849 자위), 18번 (D18S57, D18S62. D18S66와 D18S70 좌위), 19번 (D19S210 좌위), 20번 (D20S100, D2S106, D20S115, D2S117와 D20S119 좌위). 21번 (D21S262, D21S265, D21S266와 D21S270좌위), 그리고 22번(D22S274, D22S280와 D22S283 좌위)에 위치한 (CA)n의 반복 단위를 가지는 21개의 STR 마커들에 대해 대립유전자의 빈도분포를 분석하였다. 그 결과 각 마커의 상대적인 대립유전자의 빈도는 D5S416, D20S100과 D21S106좌위에서는 뚜렷한 단일 양식의 (unimodal)분포를 보였고, D18S70, D21S266과 D20S117좌위에서는 뚜렷한 이분양식의 (bimodal)분포를 보였다. 또한 나머지 마커들은 다양함을 내포하는 분포 양식인 이분양식의 (bimodal)경향을 보였다. 각 마커들에 따라 관찰된 대립유전자의 수는 D20S115좌위가 6개로 가장 적었고 D22S283과 S20S117좌위가 14개로 가장 많았다. 최다빈도를 나타내는 대립인자의 빈도는 0.622의 값을 나타내는 D20S115좌위와 0.571를 나타내는 D21S270좌위를 제외한 나머지 19개의 마커가 0.5 이하의 빈도는 나타내면서 전반적으로 낮은 값을 보였다. 또한 21개의 STP마커에 따라서 최다빈도를 나타내는 유전자형의 빈도는 9.56%내지 37.79%범위의 값을 나타내었다. 각 마커의 유전자형에 대한 Hardy-Weinberg equilibrium의 검정을 한 결과 D5S416, D18S70, D22S274, D20S106와 S10S201좌위에서는 Hardy Weinberg의 평형에서 이탈되었지만 나머지 16개의 마커에 대해서는 평행상태를 나타내었다. 이들 STR마커들은 한국인 집단에서 0.547sowl 0.865의 이형접합률을 나타내었으며 0.547의 값을 보인 D20S115좌위와 0.635의 값을 보인 D21S270좌위를 제외하고 나머지 19개의 자위가 0.7 이상의 높은 이형접합률을 보였다. 또한 이형접합률을 백인 집단과 비교해 볼 때 D21S266좌위의 경우 백인 집단에서는 0.59의 값을 보인데 비해 한국인 집단에서는 0.816의 높은 값을 보였고 D12S85좌위의 경우도 백인집단에서는 0.67의 값을 보인데 비해 한국인 집단에서는 0.842로 높았다. 그러나 D21S270 좌위의 경우는 백인집단에서는 0.85의 높은 값이었는데 비해 한국인 집단에서는 0.635의 값을 보였다. 이들 마커들의 polymorphism information content (PIC)는 0.494 (D20S115 좌위의 경우) 내지 0.851 (D20S117 좌위의 경우)의 범위로 나타나며 D20S115를 제외한 20개의 STR마커가 0.5 이상의 PIC를 보였으며 이중 17개의 마커가 0.7 이상의 PIC를 나타내어 일반적으로 (CA)n 단위를 가진 microsatellite는 높은 유용성 (informativeness)을 지님을 볼 수 있었다. 3. Dimeric STR 마커들의 특성에 따른 그리고 형광으로 표식된 primer와 자동 분석의 방법에 의한 STR 유전자형 분석의 예민도를 평가하기 위해 일련의 희석농도의 주형 DNA 부터 증폭한 결과, 21개의 STR마커에 대해 Genescanner상에서 형광 표식을 검출해내기 위해 필요한 주형 DNA의 최소량은 약 0.04 ng으로 나타났다. 이것에 비해 allele-specific oligonucleotides(ASOs) hybridization 에 의해 HLA-DQα좌위를 분석하는 경우는 주형 DNA의 최소량이 1.6ng으로 나타났고, AMP-FLP의 silver염색방법에 의해 VNTR의 D1S80좌위를 분석하는 경우에는 0.5 ng으로 나타났다. 따라서 이러한 결과는 형광 표식된 primer를 이용하는 STR마커의 유전자형 분석은 적은 양의 주형 DNA로부터 유전자형을 분석할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한 심하게 분해된 10가지 시료의 주형 DNA로부터 11개의 STR 마커에 대한 유전자형의 결과를 얻을 수 있었다. 이에 비해 allele-specific oligouncleotides (ASOs) hybridization에 의해 HLA-DQα좌위를 분석하는 경우에는 8가지 시료에서, AMP-FLP의 silver의 염색방법에 의해 VNTR의 D1S80좌위를 분석하는 경우에는 4가지 시료에 대해 유전자형의 결과를 얻을 수 있었다. 따라서 형광으로 표식된 primer와 자동적인 분석에 의한 dimeric STR마커에 유전자형 분석은 ASOs hybridization이나 AMP-FLP의 silver 염색방법보다 높은 예민성을 나타냄을 알 수 있었고 이러한 사실은 본 방법에 의한 STR마커의 유전자형 분석이 법과학에 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다. 4. 본 논문에서 얻은 한국인 집단에서의 각 마커의 유전자형의 빈도와 그의 분포로부터 개인 식별의 가능성을 평가해 보면, 21 개의 마커에 대해 최다빈도의 유전자형으로 구성된 개체가 발생할 빈도는 6.11X10-11이었고, 최소빈도 유전자형으로 구성된 개체가 발생할 빈도는 6.85X10-51의 값을 나타내었다. 또한 21개의 마커에 대해 임의의 두 개체의 유전자형이 우연히 일치된 가능성은 2.27X10-23로 나타나 두 개체가 일치된 가능성이 상당히 낮음을 보였다. 또한 각 마커에 대한 식별력은 0.737을 나타낸 D20S115좌위를 제외한 20개의 마커가 0.8이상의 값을 보였으며 D12S85와 D20S117 좌위는 0.954의 높은 식별력을 나타내었다. 따라서 이러한 결과는 dimeric STR마커에 의한 유전자형의 분석이 개인 식별을 위한 목적에 상당히 유용함을 나타내었다. 5. 21개의 마커 모두 멘델식 유전 법칙에 따라 유전됨을 볼 수 있었으며 이들의 친생자 확인에로의 유용성을 평가하기 위해 가계 분석을 하였다. 각 마커에 대한 대립인자의 빈도로부터 산출된 친자가 아님을 확인할 수 있을 가능성을 타나내는 값(the probability of nonpatenity)을 21개의 마커에 대해 조합하면 거의 100%의 값을 보였다. 또한 친생자 관계가 배제되지 않는 한 가계에서 친생자일 가능성 (the relative chance of patenity: RCP)이 dimeric STR 마커들이 친생자 관계를 확인하는데 상당히 유효함을 알 수 있었다. 본 연구의 결과는 인류의 유전적 다형현상과 그의 법과학적 적용에 대한 유용한 자료를 제시하였다고 생각되며 또한 이러한 마커들은 유전자 지도 작성, 돌연변이의 연구, 의학에서의 유전질환의 규명, 인종 기원의 규명을 위해서도 유용한 마커로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. ; Many information about genetic variation on DNA sequences have been accumulated by the development of new molecular biochemical technology for studying human genetic polymorphisms. Among the many kinds of DNA polymorphism, the polymorphisms of genetic markers based on the variable number of repeat units are displaying considerable polymorphisms and providing the complementary information. In the present study, for the investigation of population genetic characteristics of Korean population using nuclear DNA markers, twenty one short tandem repeat (STP)markers based on (dC-dA)n(dG-dT)n dinucleotide repeat sequences were analyzed to determine the allele frequency and its distribution, informativeness, and suitability for DNA typing. The present study also contained the evaluation of their application to the individual identification and paternity testing. The results were summarized as followings: 1. The accuracy and precision of band size estimates obtained by the automated real-time analysis of fluorescent amplification products were determined for twenty one markers. The average standard deviation of estimated showed ±0.212 bp in the case of the same PCR reaction on the same gel (interlane), ±0.329 bp in the case of the same PCR reaction on the different gel (intergel), ±0.265 bp in the case of the different PCR reaction on the same gel (interreaction), and ±0.411 bp in the case of the different PCR reaction on the different gel (interreaction & intergel) for STP markers. And for each dye, the standard deviations of allele size estimated were average ±0.300 bp for the blue dye, ±0.334 bp for the green dye, and ±0.323 bp for the yellow dye and were vary similar. The average accuracy and precision for twenty one markers showed 99.48% and 99.83%, respectively. Therefore, it could be exact to determine the alleles of each marker due to the high accuracy and precision. 2. This paper presented the analysis of a multilocus genotype surveying 81 to 223 individuals of Korea population for twenty one dimeric ATR makers with (CA)n repeats located on chromosome 5( D5S416 locus), 10 (D10S201 locus), 12 (D12S85 locus), 17 (D17S849 locus), 18(D18S57, D18S62. D18S66, and D18S70 loci), 19(D19S210 locus), 20 (D20S100, D2S106, D20S115, D2S117, and D20S119 loci). 21(D21S262, D21S265, D21S266, and D21S270 loci), and 22(D22S274, D22S280, and D22S283 loci). An allele frequency distribution was determined for each locus. The relative allele frequencies exhibited the obviously unimodal distribution in D5S416, D20S100, and S21S106 loci, and the obviously bimodal distribution in D18S70, D21S266, and S20S117 loci. And thirteen markers showed generally the tendency of bimodal distribution concealing a high degree of diversity. The number of alleles observed showed ranging form 6 (D20S115 locus) to 14 (D22S283 and D20S117 loci). The most common allele frequency was generally low for each marker showing below 0.5 with the exception of D20S115 (0.622) and D21S270 (0.571). The most common genotype frequency showed ranging from 9.56% to 37.79%. Although deviations from Hardy-Weinberg equilibrium were noted at five markers (D5S416, D18S70. D22S274, D20S106. and D10S201 loci), genotype data from the others were overall consistent with Hardy-Weinberg equilibrium. The heterozygosities of the markers showed ranging from 0.547 (D20S115 locus) to 0.865 (D21S270 locus) and nineteen markers with the exception of these two markers showed above 0.7. The largely different heterozygosity values were appeared for D21S266, D12S85, and D21S270 loci in comparison to the White population. These STP markers were highly polymorphic, with the polymorphism information content (PIC) values ranging from 0.494 (D20S115 locus) to 0.851 (D20S117 locus). Twenty STP markers showed a PIC above 0.5 with the exception of D20S115 and seventeen markers above 0.7, confirming the high informativeness of (CA)n microsatellites in general. 3. To evaluate the sensitivity of STP genotyping by the automated analysis of fluorescent amplification products, the amplification from the serial dilutions of template DNA was conducted and its result indicated that the minimal amount of target DNA required to detect a fluorescent signal on the Genescanner for STR markers was approximately 0.04 ng of template genomic DNA. Thus, alleic profiles would also obtained better results even from the little amount of target DNA than by allele-specific oligonucleotides (ASOs) hybridization for HLA-DQα typing showing 1.6 ng as the minimal amount of template DNA and silver staining detection for D1S80 typing showing 0.5 ng as the minimal amount of template DAN. Also allelic profiles could be obtained for all ten cases of a highly degraded state of target DNA for eleven STP markers. But HLA-DQα typing by allele-specific oligonucleotides (ASOs) hybridization and D1S80 typing by silver staining detection could be analyzed in eight cases and four cases, respectively. So, dimeric STP genotyping showed and higher sensitivity than HLA-DQα typing by ASOs hybridization and D1S80 typing by AMP-FLP and silver staining detection. Therefore, these facts represented the usefulness of forensic application of STR genotyping by the automated analysis of fluorescent amplification products. 4. From the allele and genotype frequencies of twenty one STR markers, the combined frequency of the most common genotype for twenty one markers was 6.11X10-11 and the combined frequency of the least common genotype for twenty one markers was 6.85X10-51 and the combined value of the probability of a random match (PM) for the twenty one markers was very low with 2.27X10-23. The power of discrimination was high showing above 0.8 with the exception of D20S115 (0.737_ and was the highest showing 0.954 in D12S84 and S20S117. 5. The mendelian inheritance of twenty one STR makers was confirmed form family studies. To evaluate their application to paternity testing, family studies for paternity cases were conducted. The combined probability of nonpaternity for twenty on STR markers was close to 100%. In the case that the alleged father were nor excluded, the combined relative chance of paternity (RCP) from the genotypes of ten STR markers was close to 100%. Therefore these STP markers were fairly effective for detecting paternity. Together, these results suggested that it will be possible to answer many questions about human population genetics and that dimeric STR markers are useful markers for the application to individual identification and paternity testing in forensic sciences. Also these STR markers will be useful markers for the genetic disease in medical science, and the searching of human origin.