옥수수(Zea mays L.) 뿌리의 굴중성 반응에서 활성 산소종의 역할

Abstract

Gravitropism, directional growth in response to gravity, is a general phenomenon in plants. Characterized mechanisms of gravitropism involve roles of auxin as a plant hormone. Recent evidence indicates that reactive oxygen species (ROS) may function as as intracellular messenger in growth factor and hormone signal transduction. Here we show the roles of ROS in plant gravitropism. Stimulation of maize primary roots with gravitropic stress resulted in a transient increase in the intracellular concentration of ROS. ROS accumulated in the tip of primary roots in response to gravistimulation, whereas the elongation zone reveals no change of ROS. ROS generation by gravistimulation is observed in the lower endodermis of the root tip within 30 min. H2O2­contained agar placing on a upper side of the root tip against gravity reduces gravitropic curvature, whereas the agar placing on a lower side of the root tip stimulates increase in gravitropic curvature. Scavenging of generated ROS by N-acetylcysteine (NAC) inhibits gravitropism. The natural auxin, IAA (Indole-3-acetic acid), induced H2O2 in maize roots. When seedlings were incubated in a 5 μM IAA solution, ROS production was increased and reached the maximum content at 60 min. The efficient concentration of IAA for the ROS production in maize roots was 5 μM. PCIB (α-(p-chlorophenoxy)isobutyric acid), anti auxin, reduced IAA effects on ROS generation. And other synthetic hormones such as 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) and α-NAA (α-naphthalene acetic acid) also induced ROS. However, β-NAA (β-naphthalene acetic acid), an inactive auxin, did not cause ROS generation suggesting that ROS production by IAA is related to functional mechanism of gravitropism. It was also found that phosphatidylinositol 3-kinase (PI3­kinase) may function as a downstream component in auxin-mediated signal transduction in root gravitropism and the effect of auxin on H2O2 generation was blocked by the PI3K inhibitors LY294002. These results suggest that a product of PI3K is required for auxin-induced production of H2O2 in plant cells. The generation of ROS by gravistimulation is essential for the phosphorylation and activation of p38MAPK like plant MAP kinase in maize roots, although not of ERK2. Furthermore, NAC-pretreatment of roots abolished the activation of p38MAPK like plant MAP kinase. The result suggests that the activation of p38MAPK like plant MAP kinase by ROS is essential for root gravitropism and p38MAPK like plant MAP kinase was a potential target for gravistmulation-induced ROS. We next asked the signal transduction roles of ROS in response to auxin and investigated intracellular Ca2+ mobilization. When protoplasts were treated with IAA, intracellular calcium levels were increased. Furthermore, scavenging of ROS by NAC treatment abolished intracellular calcium mobilization. As soon as H2O2 was added into protoplasts, intracellular calcium levels were promptly raised up. These results indicate that ROS is an essential factor for the intracellular calcium movement. We also investigated the role of ROS in auxin-induced ethylene generation. ROS induced ethylene generation by activation of ethylene synthesis enzymes and auxin-induced ethylene generation was inhibited by NAC. These results show that ROS plays role as a signal transducer in auxin-induced ethylene generation. To identify the target molecules of gravistimulation induced­ROS in maize roots, biotin-labeled iodoacetate was engaged. Three candidate proteins (43 kDa, 40 kDa, and 23 kDa) were detected in gravistimulated roots. Among thease candidates, the 43 kDa target protein is proven as Gαi. The results in this research indicate that ROS plays an important role as a second messenger in plant gravitropism.

; 본 연구에서는 최근 새롭게 부각된 이차신호전달물질인 활성 산소종 (Reactive oxygen species, ROS)이 뿌리의 굴중성 반응에서 수행하는 역할에 대해 조사하였다. 그 결과 옥수수 뿌리조직에서 중력 자극에 의해 활성 산소종이 빠르게 생성, 소멸됨을 확인하였고 이러한 양상은 식물의 중력반응에서 활성 산소종에 의한 신호전달 매개 가능성을 보여준다. 이러한 활성 산소종의 차등적 분포를 고농도의 H2O2 혹은 항 산화제를 처리하여 제거한 경우 굴중성 반응이 억제되었다. 이는 활성 산소종과 항 산화제를 비대칭적으로 첨가한 뿌리에서 굴중성 반응을 조사함으로써 더욱 확실히 알 수 있는데, 중력 자극을 줄 때 뿌리 아래 면에 활성 산소종을 처리한 경우 굴중성 반응이 촉진되는 반면, 윗면에 처리하여 주면 굴중성 반응이 억제되었다. 그러나 이와 같은 방법으로 항산화제인 N-acetylcysteine (NAC)을 아래 면에 처리해 주면 굴중성 반응이 억제되고 윗면에 처리해 주면 오히려 촉진된다. 따라서 중력 자극시 활성 산소종이 편재된 상태로 생성 분포하는 것이 굴중성 반응에 중요하다. Auxin의 이동 저해제인 NPA 처리로 억제되었던 굴중성 반응이 H2O2를 아래 면에 첨가한 경우 회복되었다. 또한, 원형질체를 사용하여 auxin 처리시간에 따른 활성 산소종의 생성 양상을 살펴본 결과 10분 이내의 빠른 시간에 최고 수준에 도달하고 또한 빠른 속도로 대조구 수준까지 낮아짐을 확인하였다. 이러한 auxin에 의한 활성 산소종 생성 유도는 auxin의 활성이 전제되어야 한다는 것을 알 수 있었다. 또한 활성 산소종의 생성이 유도될 때 PI3­kinase가 관여할 것으로 생각된다. PI3­kinase의 특이적 저해제인 LY294002를 이용하여 PI3­kinase와 굴중성 그리고 활성 산소종과의 관계를 알아보았는데 LY294002는 굴중성반응을 억제하고 중력자극과 auxin에 의해 유도되는 활성 산소종의 생성도 억제하였다. 또한 EEA1을 과잉발현시켜 PI3P의 신호전달을 억제시키면 auxin에 의한 활성 산소종의 생성이 저해됨을 확인하였다. 따라서 PI3­kinase의 활성화와 그 생산물인 PI3P에 의해 auxin이 유도하는 활성 산소종의 생성 기구가 조절될 것으로 생각되며 이러한 경로를 통해 중력 자극에 의한 활성 산소종의 생성도 조절될 것으로 예상된다. 중력 자극이 유도하는 활성 산소종의 대상 물질을 규명하기 위해 MAP kinase (MAPK)와 Ca2+, 그리고 auxin이 유도하는 ethylene 생성이 활성 산소종과 어떠한 관계가 있는지 알아보았다. 그 결과 MAPK 저해제에 의하여 중력반응이 억제되고 중력 자극에 의해 p38 MAPK가 활성화되며 활성은 NAC에 의해 억제되었다. 이는 중력 자극에 의해 활성화되는 MAPK가 활성 산소종에 의해 조절 받을 뿐 아니라 그 대상 물질임을 암시한다. 활성 산소종과 auxin에 의한 Ca2+ 이동의 변화를 알아본 결과 활성 산소종과 auxin에 의해 Ca2+의 이동이 일어나 세포질의 Ca2+농도가 증가하였으며 NAC을 전처리 해주면 이러한 반응이 사라졌다. 이 결과로 중력 자극시 생성되는 활성 산소종에 의해 의 이동이 조절될 것을 예상할 수 있다. 또한 활성 산소종에 의해 유도되는의 이동은 PI3­kinase의 저해제인 LY294002에 의하여 억제되는 것을 확인하였는데, 활성 산소종의 생성에 PI3­kinase가 관여하기 때문에 활성 산소종의 생성정도에 따라의 이동이 조절될 것으로 생각된다. 활성 산소종에 의해서 ethylene 생성이 유도됨을 확인하였는데 이는 ethylene 생합성 효소의 활성을 증가시키기 때문이며 auxin에 의한 ethylene 생합성의 증가가 NAC 처리에 의해 그 효과가 저해되었다. 따라서 활성 산소종이 auxin의 ethylene 생성 유도를 조절할 것으로 생각된다. 그러나 ethylene 생합성이 억제되었을 때 auxin에 의한 활성 산소종의 생성은 변화가 없는 것으로 보아 ethylene에 의해 활성 산소종의 생성은 영향받지 않는 것으로 보인다. 중력 반응시 유도되는 활성 산소종의 대상 단백질을 알아본 결과, pKa가 4.5정도이고 분자량이 43 kDa인 단백질이 대상물질로 밝혀졌으며 여러 가지 G protein의 항체를 이용하여 western blot을 수행한 결과 43kDa의 대상 단백질은 Gαi 으로 밝혀졌다.