국내 HIV type 1과 type 2 감염진단을 위한 혈청학 및 분자유전학적 연구

Abstract

HIV (Human immunodeficiency virus)의 유전적 다양성과 감염자의 질병진전에 따른 항체반응의 차이 및 진단제의 비특이 반응 등은 정확한 HIV 감염진단에 많은 어려움을 주고 있다. 따라서 이러한 문제들을 해결하고자 1985년부터 1999년까지 HIV 혈청 및 면역학적 시험결과와 분리주의 유전학적 분석을 바탕으로 한국인 HIV 감염자의 혈청학적 특징과 HIV 분리주의 유전적 다양성의 관계를 분석하여 다음과 같은 연구결과를 얻었다. 1. 국내 HIV 항체양성판정 기준의 타당성을 검토하고자 indeterminate (IND) 웨스턴블롯의 밴드양상 분석을 통한 항체양성전환 위험 (seroconversion risk)과 각 항체밴드의 양성 예측가를 조사하였다. 첫째 gp160+p24가 468의 가장 높은 교차비를 나타냈으며 이 밴드는 국내 양성판정의 최소기준으로 적용될 수 있을 것으로 보인다. 둘째 양성 예측가가 3.6으로 낮게 측정된 gp41 밴드의 해석에 좀 더 주의를 가지고 판정해야하는 점이다. 현재 진단시약으로 실험하여 gp41+p31이나 gp41+p24를 양성으로 판정하는 기준을 선택한다면 많은 위양성이 산출될 가능성이 있다. 셋째 높은 항체 예측가를 지닌 gp160 env 밴드를 포함하고 gag나 pol 이 있는 일부 혈청의 항체밴드 양상이 추적검사 결과에서는 일차 혈청과 불일치한 시험결과를 나타내는 것이 관찰되었다. 우리 나라와 같이 HIV 유병율이 낮고 양성 결과의 판정에 따른 커다란 사회적 파장을 고려하면 추적검사가 HIV 감염판정을 위해 계속 수행되어야 할 것으로 생각된다. 넷째 277건 중 1건이 seroconversion 사례가 알려진 만큼 p24 항체밴드를 보인 IND 혈청의 seroconversion 가능성을 배제할 수는 없을 것으로 보인다. 2. 국내에서 HIV-2 감염정도를 결정하고 HIV-2 분리주의 염기서열에 의한 특성분석에서는 91년에서 99년까지 5명의 HIV-2 감염자를 혈청학적 방법과 효소중합연쇄반응 (Polymerase chain reaction)시험으로 확인하였다. gag와 env 부위의 정렬에 기초한 유전학적 분석은 5명중 3명의 분리주가 subtype A로 확인되었고 국내 분리주의 HIV-2의 뉴클레오티드의 변이는 1191bp env 부위에서는 12.8%에서 13.1%의 높은 다양성을 보였다. 전세계적으로 HIV-2 감염보고 사례가 적고 발견지역이 국한되어 있음에도 불구하고, 국내에서 5례의 감염자를 확인한 것은 우리나라 HIV의 다양성을 확인한 것이며, 향후 HIV의 감염진단에 이와 같은 다양성을 고려하여야 할 것으로 판단된다. 3. HIV type 2 (HIV-2)항원에 대한 HIV type 1 (HIV-1) 감염자의 교차반응 정도와 교차반응을 일으키는 HIV 유전자 특성을 분석하였다. HIV-2 입자응고법에서 15.9%, 웨스턴 블롯법에서는 gag p26 항원에 93.1%, env gp140 항원에 33.3%의 교차반응이 나타났다. 2개의 env에 교차반응을 보이는 감염자의 분리주와 알려져 있는 HIV-2의 gp120 C2-C5 부위의 아미노산서열 비교에 의하면 C4부위에서 43.77%, V3에서 30.26%와 C5에서 29.68%의 상동성이 관찰되었다. HIV-2에 교차반응을 보인 개체와 교차반응이 없는 HIV-1 감염자의 signature pattern 비교에서는 gp120 V1-C5부위의 32 sites에서 아미노산 잔기가 서로 다른 것으로 분석되었으며, 특히 50% 이상의 차이를 보이는 C5 및 V2 부위의 4 sites가 HIV-2와의 교차반응을 설명할 수 있는 부위로 생각된다. 4. HIV 감염자 집단에서 웨스턴블롯 항체 밴드의 강도와 CD4+ 림프구 수와의 관계 분석에서 첫째, 국내 HIV seroconverter에서 gp160, p24 항체가 강하게 검출되는 반면 p55, 17 항체는 검출하기 어려웠다. 둘째, HIV seroconverter 및 CD4+ 세포수 수준에 의해 분류된 HIV 감염자 집단에서 p24 항체가 높게 유지되면 CD4+ 수가 높게 나타났으며 또한 rapid progressor와 slow progressor 집단에서 p55 항체가 존재하지 않으면 질병진전이 빠른 것으로 분석되어 p24, p55의 gag 항체가 질병진전과 관련있는 것으로 분석되었다. 셋째 glycoprotein에 대한 항체가 높게 유지되면 CD4+ 세포수가 감소한 분석결과는 향후 gag와 env 항체의 enhancing 역할 등에 관한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 보인다. 이러한 연구결과는 정확한 HIV 감염진단, HIV-2의 감염을 확인할 수 있는 실험실 검사전략 수립, HIV-1과 HIV-2를 구별할 수 있는 HIV 진단법 개발 및 HIV-1과 2의 두 type 모두를 예방할 수 있는 백신개발을 위한 바이러스 주 선정의 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다. ; Genetic heterogenicity of HIV (Human immunodeficiency virus), differences in antibody responses by HIV disease progression and nonspecific reaction of diagnostic reagents present some amount difficulty in diagnosis of HIV infection. In order to solve the above problems, the author analysed serological characteristics of the individuals with HIV infections and relationship between genetic diversity of HIV isolates and serological characteristics. The results obtained through the study are as followings; 1. Seroconversion risk of HIV indeterminates and positive predictive value of viral protein bands were surveyed through analysis of indeterminate band patterns in order to discuss the rationale for criteria of HIV positive interpretation. Firstly, band patterns of gp160 plus p24 showed the highest odd ratio of 468 and could be applied to minimum criteria for HIV positive interpretation. Secondly, one should be very careful in the interpretation of gp41 band with odd ratio of 3.6. If band patterns of gp41 plus p31 or gp41 plus p24 were accepted as a positive criteria, it might produce a high possibility of false positive in Korea. Thirdly, it was observed that serum showing gp160 plus gag or pol bands showed discordant result with follow-up sera tested. Follow-up tests should be continued even on these sera when considering low prevalence rate of HIV infection in Korea and big social impact caused by false positive reading. Fourthly, indeterminate sera showing only p24 band seem to have possibility of positive because one sera out of 277 was converted to positive. 2. The scale of HIV-2 infection in Korea were surveyed and nucleotide sequences of HIV-2 isolates were characterized. HIV-2 infection seems to be introduced into Korea in 1991 and five individuals with HIV-2 infection by 1999 were confirmed by serological methods and polymerase chain reaction (PCR) methods. Based on genetic analysis on gag and env gene, three of five individuals with HIV-2 were confirmed to be subtype A and high diversity of 12.8% to 13.1% in 1191 bp env of HIV-2 isolated from HIV-2 infected individuals found in Korea. Considering that there were only five individuals with HIV-2 by 1999, the speed of HIV-2 transmission in Korea is not can not be said be rapid. However, 속 confirmation of five HIV-2 infected individuals in Korea could mean the confirmation of HIV diversity in Korea. Furthermore, it is imperative that diversity of HIV isolates in Korea should be considered for the diagnosis of HIV infection. 3. The extend of cross reaction of HIV-1 antibodies to HIV-2 antigen and gene sequences causing cross reactions were analysed. The extend of cross reactions in HIV-1 infected individuals were 15.9% in HIV-2 particle agglutination, 93.1% of gag p26 and 33.1% of env gp140 in western blot. Compared with amino acid of gp120 C2-C5 regions of HIV-2 reference isolates and the corresponding region of HIV-1 isolates having cross reaction to at least two env antigens, homologies of 43.77% in C4, 30.26% in V3 and 29.68% in C5 region were observed. Compared with amino acid of gp120 V1-C5 regions of HIV-1 isolates without cross reactions and with cross reaction, significant difference at 35 sites was analysed. Particularly 4 sites showed 50% differences between two groups were confirmed in C5 and V1 region and these sites are thought to explain cross reactions to HIV-2 antigen. 4. Relationship between intensity of bands by western blot and number of CD4+ cells was analyzed on individuals with HIV in Korea. Firstly, HIV seroconverters in Korea showed strong reactivity to gp160 and p24, whereas antibodies to p55 and p17 were rarely detected. Secondly, HIV infected individuals classified by CD4 level and seroconverters showing strong antibody reaction to p24 viral antigen had high number of CD4 cells. And also, rapid progress of diseases in patients without antibodies to p55 was observed when groups of rapid progress and low progress were compared with. Thirdly, to explain the result that seroconverter showing strong reactivity to env showed lower the number of CD4 cells, there is a strong need for the further study about the roles of enhancing antibodies in gag and env antibodies. These findings can be utilized for the accuracy in diagnosis of HIV infection, the establishment of testing strategy to confirm HIV-2 infection, developement of testing methods for differentiation of both HIV types and the selection of target epitope for HIV vaccine development which can prevent HIV infection of HIV-1 and HIV-2.