Nitric oxide 생성 억제제 L-nitroarginine이 백서 뇌의 GABAA 수용체 발현에 미치는 영향

Abstract

Nitric oxide(NO)는 아미노산인 L-arginine으로부터 nitric oxide syntase(NOS)에 의해 합성되어지는 소량의 확산성 물질으로서 수많은 생리적 병리적 과정에 관여하는 일종의 신경전달물질이다. 뇌에서 NO의 생리적 역할은 presynapse에서 신경전달물질의 유리에 영향을 미치고 N-methyl-D-aspartate(NMDA) 및 gamma aminobutyric acid (GABA) 수용체의 활성화와 관련이 있다고 알려져 왔다. GABA는 중추신경계의 주요 억제 전달물질이며 GABA는 GABA 수용체와 결합하여 GABA_A 수용체의 Cl- 통로를 열어 신경흥분을 억제시킨다. 분자생물학적인 연구결과 GABA_A 수용체는 여러 개의 subunit가 조합을 이루어 pentamer로 존재함이 알려졌고 각기 다른 subunit의 조합으로 수용체의 약물학적, 생리학적 특성이 결정됨이 밝혀졌다. 본 연구에서는 nitric oxide syntase(NOS) 억제제인 L-nitroarginine(NA)의 지속적인 뇌실 투여로 뇌에서 NO 생성을 저하시킬 경우, GABA_A 수용체 활성을 어떻게 변화시키는지, 그리고 이러한 수용체의 변화와 연관이 있는 GABA_A 수용체 mRNA의 발현은 어떻게 달라지는지 알아보고자 시행했다. NOS의 전신투여에서 나타나는, 혈압과 뇌혈류에 미치는 영향을 베제하기 위하여, 백서의 뇌실에 두개 정위적 방법으로 관을 삽입하여 뇌실에 직접osmotic minipump를 연결해서 7일 동안 NOS 억제제인 NA(10, 100 pmol/10ul/hr)를 주입한 후 뇌를 박편화하여 GABA_A 수용체 리간드인 [3H]muscimol, [3H]flunitrazepam, [35S]TBPS를 이용하여 GABA_A 수용체에의 결합능을 autoradiography로 분석하였고, in situ hybridization 기술을 통해 GABA_A 수용체 subunit mRNA의 발현 변화를 측정하였다. 그 결과, NA에 의한 지속적 NOS 억제는 pentobarbital 유도 수면시간을 단축시켜, 급성적으로 NOS 억제제를 처치할 때의 수면시간 증가현상과 반대로 나타났다. 한편, [3H]muscimol과 [3H]flunitrazepam 결합은 각 리간드 마다, 부위별로 다르게 증가되었으나 [35S]TBPS 결합은 변화가 없었다. 그리고 NOS 억제제에 의한 GABA_A 수용체 subunit mRNA발현은 각 subunit마다 다른 뇌영역에 변화를 보였다. 이러한 결과로, NO 생성을 억제할 경우, 처치 시간(기간)에 따라 GABA_A의 수용체 기능이 다르게 변화하였고 특히 뇌에서 NO 생성을 장기간 억제할 경우 뇌 부위 특이적으로 GABA_A 수용체 subunit mRNA발현에 각기 다른 영향을 주어 GABA_A 수용체 발현과 NO의 상호관계는 다양한 분자생물학적인 조절기전이 관여한다는 것을 제시하여 준다. ; These studies were designed to examine the effect of chronic administration of a nitric oxide synthase(NOS) inhibitor on the modulation of GABA_A receptor expression in adult rat. To define the role of nitric oxide on sleep, a NOS inhibitor, L-nitroarginine(NA) was treated to rat acutely. The duration of sleep by pentobarbital(60 mg/kg, i.p.) injection was significantly increased by the pre-treatment with NA(10-100 mg/kg, i.p.) in rats. However, the pentobarbital-induced sleep was shortened by the continuous intracerebroventricular(i.c.v.) infusion of NA(100 pmol/10ul/hr) for 7 days. Furthermore, I have investigated the effects of prolonged inhibition of NOS by infusion of NA, to examine the modulation of GABA_A receptor binding and GABA_A receptor subunit mRNA level in rat brain. We have investigated the effect of NOS inhibitor on GABA_A receptor binding characteristics in discrete brain regions by using autoradiographic and in situ hybridization techniques. The GABA_A receptor bindings were analyzed by quantitative autoradiography using [3H]muscimol, [3H]flunitrazepam, and [35S]TBPS in rat brain slices. Rats were infused with NA(10, 100 pmol/10 ul/ hr, i.c.v.) for 7 days, through pre-implanted cannula by osmotic minipumps. The levels of [3H]muscimol and [3H]flunitrazepam binding were highly elevated in almost all of brain regions including cortex, caudate putamen, thalamus, hippocampus, and cerebellum. However, the level of [35S]TBPS binding was not changed. The levels of β2-subunit were elevated in the cortex, brainstem, and cerebellar granule layers while the levels of β3-subunit were significantly decreased in the cortex, hippocampus, and cerebellar granule layers in NA-infused rats. The levels of α6- and δ-subunits, which are highly localized in the cerebellum, were not changed in the cerebellar granule layer after NA treatment. These results show that the prolonged inhibition of NOS by NA-infusion strongly elevates [3H]muscimol and [3H]flunitrazepam binding throughout the brain, and alters GABA_A receptor subunit mRNA levels in different directions. The chronic inhibition of NO generation has differential effect on various GABA_A receptor subunits, which suggests involvement of differential regulatory mechanisms in interaction of NO with the GABA receptor expression.